Summary

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em> Burnetii Coxiella</em> Durante siRNA Silencing

Published: July 06, 2016
doi:

Summary

Indagare le interazioni tra batteri patogeni ei loro ospiti è un'area importante della ricerca biologica. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per misurare effettrici traslocazione da Coxiella burnetii durante siRNA silenziamento genico mediante substrato Blam.

Abstract

Coxiella burnetii, l'agente eziologico della febbre Q, è un patogeno intracellulare che si basa su un tipo IV Dot / Icm secrezione di sistema per stabilire una nicchia replicativa. Una coorte di effettori sono traslocato attraverso questo sistema nella cellula ospite per manipolare i processi di accoglienza e consentire la creazione di un vacuolo lisosoma di derivazione unica per la replica. Il metodo qui presentato comporta la combinazione di due tecniche ben consolidate: specifica silenziamento genico con siRNA e misura di traslocazione effettore utilizzando un substrato FRET-based che si basa sull'attività β-lattamasi. L'applicazione di questi due approcci, possiamo cominciare a comprendere il ruolo dei fattori di accoglienza in batterico funzione del sistema di secrezione e traslocazione effettrici. In questo studio abbiamo esaminato il ruolo di Rab5A e Rab7A, entrambi importanti regolatori del percorso traffico endocitico. Abbiamo dimostrato che il silenziamento dell'espressione di una proteina risultati in una diminuzione della effettori translocatioefficienza n. Questi metodi possono essere facilmente modificati per esaminare altri agenti patogeni intracellulari ed extracellulari che utilizzano anche sistemi di secrezione. In questo modo, un quadro globale dei fattori di accoglienza che partecipano batterica traslocazione effettrici può essere rivelata.

Introduction

Coxiella burnetii è un patogeno intracellulare unico che provoca la febbre Q infezione umana zoonotici. Questa malattia è associata con un ampio spettro di manifestazioni cliniche che si estendono dalla sieroconversione asintomatica a infezione cronica pericolosa per la vita, che spesso si manifesta come anni endocardite dopo l'esposizione 1. L'infezione umana avviene principalmente attraverso l'inalazione di aerosol contaminati con ruminanti il ​​principale serbatoio di infezione, in particolare, vacche da latte, pecore e capre. Anche se l'infezione Coxiella in questi animali è in genere subclinica, l'infezione può innescare l'aborto e la notevole carica batterica all'interno del fluido parto e la placenta può contaminare l'ambiente locale 1. Un esempio di enorme peso tale contaminazione può avere sia la salute pubblica e il settore agricolo è stato recentemente osservato nel focolaio febbre Q che si è verificato nei Paesi Bassi 2. Tra il 2007 eIl 2010, oltre 4.000 casi umani di febbre Q sono stati diagnosticati e questa epidemia era legata alla contaminazione significativa delle aziende agricole di capra 3. Inoltre, Coxiella è un potenziale arma biologica, come classificati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie, a causa della stabilità ambientale dei batteri e bassa dose infettante necessaria per causare grave morbilità e mortalità 4.

Coxiella esiste in due fasi: Fase I microrganismi, isolati da fonti naturali, sono estremamente virulenti e organismi di fase II sono molto attenuate in vivo. Ad esempio, dopo diversi passaggi in vitro degli organismi Coxiella burnetii Nine Mile Fase I, Fase II, i batteri sono stati prodotti che contengono una delezione cromosomica irreversibile conseguente lipopolisaccaride tronco (LPS) 5. Questo ceppo, C. burnetii NMII, è fenotipicamente simile alla Fase I in modelli di coltura di tessuti e fornisce una modalità più sicural per i ricercatori di studiare Coxiella patogenesi nei laboratori 5. Negli ultimi anni molti passi avanti sono rapidamente avanzato il campo della genetica Coxiella. Più in particolare, lo sviluppo dei mezzi di comunicazione axeniche (acidificato medio cisteina citrato – ACCM-2) ha permesso la crescita privo di cellule di Coxiella sia liquido e su supporti solidi 6,7. Ciò ha determinato miglioramenti diretti di strumenti genetici disponibili per Coxiella tra cui un sistema di espressione del gene inducibile, vettori navetta e sistemi di trasposoni casuali 8-11. Più di recente, sono stati sviluppati due metodi per l'inattivazione genica mirata, aprendo la strada per l'esame specifico di virulenza geni candidati 12.

A seguito di interiorizzazione da parte dei macrofagi alveolari, Coxiella replica ai numeri elevati all'interno di un vano di membrana definito il Coxiella- contenente vacuolo (CCV). Il CCV richiede traffico endocitico ospite esimogrezzi precoce e tardiva endosomi fino a quando non matura in un organello lisosoma di derivazione 13. In tutto questo processo, il CCV acquisisce fattori dell'ospite che o appaiono transitoriamente o rimanere connessi con il vacuolo, compresi, ma non limitatamente a, Rab5, Rab7, CD63 e LAMP-gennaio 13-15. La replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti è interamente dipendente da un Dot / Icm Tipo IVB secrezione sistema completamente funzionante (T4SS) 8,16,17. Questo sistema di secrezione è una struttura multi-proteina ancestrally relative ai sistemi di coniugazione e si estende su entrambi membrane batteriche e vacuolari per fornire proteine ​​batteriche, definito effettori, nel citoplasma ospitante 18. Il Coxiella T4SS è funzionalmente molto simile al ben caratterizzato tipo IVB Dot / Icm secrezione Sistema di Legionella pneumophila 19,20. È interessante notare che l'attivazione del T4SS e successiva effettore traslocazione avviene solo Coxiella raggiunge l'acido lisosoma derivatoorganello, circa 8 ore dopo l'infezione 17,21. Ad oggi, più di 130 effettori Dot / ICM sono stati identificati 9,17,22-24. Molti di questi effettori probabilmente svolgono un ruolo importante durante la replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti; tuttavia, solo pochi effettori sono stati funzionalmente caratterizzata 25-29.

In questo studio utilizziamo un saggio di traslocazione di fluorescenza base che si basa sulla scissione del substrato CCF2-AM FRET (di seguito denominato il substrato blam) attraverso attività di β-lattamasi all'interno del citoplasma della cellula ospite (Figura 1). Il gene di interesse è fuso TEM-1 β-lattamasi (blam) su un plasmide giornalista che fornisce espressione costitutiva. Il substrato BLAM è composto da due fluorofori (cumarina e fluoresceina) che formano una coppia FRET. Eccitazione dei risultati cumarinici in FRET della fluoresceina e l'emissione di fluorescenza verde in assenza di effettore traslocazione; Tuttavia, se il BlaM-effector proteina di fusione viene traslocato nel citoplasma ospite, la risultante β-lattamasi attività fende l'anello β-lattamici del substrato Blam, che separa la coppia FRET produrre blu emissione di fluorescenza a seguito di eccitazione. Questo test traslocazione è stato ben dimostrato come un approccio per identificare le proteine ​​effettrici da una gamma di diversi batteri intracellulari ed extracellulari, tra cui C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogena E. coli, Salmonella e Brucella 17,30-35.

Per determinare il ruolo dei fattori di accoglienza specifici su Coxiella effettrici traslocazione utilizziamo un metodo consolidato per silenziamento gene noto come interferenza dell'RNA, in particolare piccoli RNA interferenti (siRNA). Originariamente identificato nel Caenorhabditis elegans, interferenza dell'RNA è un processo cellulare endogena conservato utilizzato per defe innataNSE contro i virus così come gene regolamentazione 36,37. Dopo il legame di specifiche sequenze siRNA, degradazione del mRNA avviene attraverso RISC (RNA-indotta complesso tacere) con conseguente specifico silenziamento genico o atterramento 38. In questo studio, siRNA è stato utilizzato per indirizzare due proteine ​​ospitanti, Rab5A e Rab7A, che sono importanti regolatori della via endocitico. L'impatto di tacere Rab5A e Rab7A su effettori traslocazione è stata determinata mediante C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 è stato scelto in quanto è stato precedentemente dimostrato di essere traslocata dal sistema di secrezione Dot / Icm di Coxiella 17.

Utilizzando sia siRNA silenziamento genico e il saggio di traslocazione fluorescencebased descritto qui, stiamo cominciando a definire un ruolo per fattori di accoglienza nella traslocazione di proteine ​​effettrici da Coxiella. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di entrambi batteri intracellulari ed extracellulari che possiedono secretio similesistemi n responsabili della traslocazione di proteine ​​effettrici.

Protocol

Nota: Tutte le procedure che coinvolgono la crescita o la manipolazione di Coxiella burnetii RSA439 NMII devono essere eseguite in un livello di contenimento fisico 2 Laboratorio e all'interno di una cappa di sicurezza biologica in conformità con le linee guida locali. Un diagramma schematico del flusso di lavoro trasfezione e dosaggio traslocazione inversa descritto di seguito è mostrata in figura 2. 1. Preparazione di C. burnetii cultura Esprimendo CB…

Representative Results

Per questo studio, la C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo è stato selezionato come CBU0077 è stato precedentemente dimostrato di essere un effettore traslocato del sistema di secrezione coxiella Dot / Icm 17. Prima di infezione, il numero totale dei genomi / ml in i sette giorni d'C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stato enumerato utilizzando qPCR. La figura 4 dimostra un esempio della soglia di ciclo valori (Ct) attesi …

Discussion

sistemi di secrezione, e le proteine ​​effettrici batteriche questi sistemi di trasporto nel citoplasma delle cellule ospiti, sono una componente importante di virulenza che molti batteri patogeni utilizzano per stabilire una infezione all'interno di nicchie replicative unici. L'attenzione di molti gruppi di ricerca è stato quello di indagare l'interazione tra effettori batterici e proteine ​​host e l'influenza di questi effettori hanno sui percorsi cellulari ospitanti. la ricerca molto limitata…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Materials

Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5X siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

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Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

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