Summary

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em> Coxiella burnetii</em> Tijdens siRNA Silencing

Published: July 06, 2016
doi:

Summary

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Abstract

Coxiella burnetii, de verwekker van Q-koorts is een intracellulair pathogeen die is gebaseerd op een Type IV Dot / Icm secretiesysteem een replicatieve niche richten. Een cohort van effectoren van translocatie via dit systeem in de gastheercel gastheerprocessen manipuleren en kan de instelling van een uniek lysosoom afgeleide vacuole voor replicatie. De hier gepresenteerde methode omvat de combinatie van twee goed gevestigde technieken: specifiek gen silencing middels siRNA en meting van effector translocatie gebruik van een op FRET gebaseerde substraat dat is gebaseerd op β-lactamase-activiteit. De toepassing van deze twee benaderingen, kunnen we beginnen met de rol van gastheerfactoren in bacteriële secretie systeem functioneren en effector translocatie begrijpen. In deze studie onderzoeken we de rol van Rab5A en Rab7A, beide belangrijke regulatoren van de endocytische mensenhandel route. We tonen aan dat silencing de uitdrukking van eiwit resulteert in een afname van effector translocation efficiency. Deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere intracellulaire en extracellulaire pathogenen die ook secretie systemen gebruiken onderzoeken. Op deze wijze kan een globaal beeld van gastheerfactoren betrokken in bacteriële translocatie effector geopenbaard.

Introduction

Coxiella burnetii is een unieke intracellulaire ziekteverwekker die de zoönotische menselijke besmetting Q-koorts veroorzaakt. Deze ziekte wordt geassocieerd met een breed spectrum van klinische presentaties uitstrekt van asymptomatische seroconversie tot levensbedreigende chronische infectie die vaak manifesteert als endocarditis jaar na blootstelling 1. Menselijke besmetting ontstaat voornamelijk door inhalatie van gecontamineerde aërosolen met herkauwers grote reservoir van infectie, in het bijzonder melkkoeien, schapen en geiten. Hoewel Coxiella-infectie bij deze dieren is meestal subklinische, kan de infectie leiden tot abortus en de aanzienlijke bacteriële belasting in het geboorteproces vloeistof en placenta kan de lokale omgeving 1 besmetten. Een voorbeeld van de enorme last dergelijke vervuiling kan hebben op zowel de volksgezondheid en de landbouwindustrie onlangs waargenomen in de Q-koorts die zich in Nederland 2. Tussen 2007 en2010, meer dan 4.000 menselijke gevallen van Q-koorts werden gediagnosticeerd en deze uitbraak was gekoppeld aan significante besmetting van geitenhouderijen 3. Bovendien, Coxiella een potentieel biologisch wapen, zoals geclassificeerd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention, vanwege de milieustabiliteit van de bacteriën en lage infectieuze dosis nodig ernstige morbiditeit en mortaliteit 4 veroorzaken.

Coxiella bestaat in twee fasen: Fase I organismen, geïsoleerd uit natuurlijke bronnen, zijn zeer virulent en Fase II organismen sterk verzwakt in vivo. Bijvoorbeeld, na een aantal overzettingen in vitro van Coxiella burnetii Nine Mile organismen Fase I, Fase II bacteriën werden geleverd dat een onomkeerbare chromosomale deletie bevatten waardoor afgeknotte lipopolysaccharide (LPS) 5. Deze stam C. burnetii NMII, fenotypisch vergelijkbaar met Fase I in weefselkweek modellen en zorgt voor een veiligere modusl voor onderzoekers om Coxiella pathogenese in laboratoria 5 bestuderen. De laatste jaren hebben verscheidene doorbraken snel gevorderd het gebied van Coxiella genetica. Het meest opvallend is de ontwikkeling van axenische media (aangezuurd citraat cysteine ​​midden – ACCM-2) heeft het celvrije groei van Coxiella toegestaan ​​in zowel vloeibare en vaste media 6,7. Dit resulteerde in de directe verbetering van genetische hulpmiddelen beschikbaar voor Coxiella waaronder een induceerbare genexpressie systeem, shuttle vectoren en willekeurig transposon systemen 8-11. Meest recent, twee methoden voor doelgerichte geninactivatie zijn ook ontwikkeld, die de weg vrijmaakt voor de behandeling van specifieke virulentie-gen kandidaten 12.

Na internalisatie door alveolaire macrofagen, Coxiella gerepliceerd naar grote aantallen binnen een membraangebonden compartiment aangeduid als de Coxiella- met vacuole (CCV). Het CCV vereist gastheer endocytische mensenhandel thruwe vroege en late endosomen, totdat het rijpt in een lysosoom afgeleide organel 13. Gedurende dit proces, verkrijgt het CCV gastheer factoren die ofwel verschijnen tijdelijk of verbonden blijven met de vacuole, waaronder, maar niet beperkt tot, Rab5, Rab7, CD63 en LAMP-13-15 januari. Replicatie van Coxiella binnen gastheercellen is volledig afhankelijk van een volledig functionele Dot / Icm Type IVB Afscheiding System (T4SS) 8,16,17. Dit afscheidingssysteem is een multi-eiwitstructuur ancestrally betrekking conjugatie systemen en omvat zowel bacteriële als vacuolaire membranen bacteriële eiwitten leveren, genaamd effectoren, in de gastheercel cytoplasma 18. De Coxiella T4SS functioneel vergelijkbaar met de goed gekarakteriseerde Type IVB Dot / Icm afscheidingssysteem van Legionella pneumophila 19,20. Interessant is dat activering van de T4SS en daaropvolgende translocatie effector pas optreedt Coxiella de zure lysosoom afgeleide bereiktorganel, ongeveer 8 uur na infectie 17,21. Tot op heden hebben meer dan 130 Dot / Icm effectoren geïdentificeerd 9,17,22-24. Veel van deze effectoren waarschijnlijk een belangrijke rol spelen tijdens de replicatie van Coxiella binnen gastheercellen; Echter, slechts een paar effectoren zijn functioneel gekarakteriseerd 25-29.

In dit onderzoek gebruiken we een fluorescentie gebaseerde translocatie assay die is gebaseerd op splitsing van de CCF2-AM FRET substraat (hierna het BLAM substraat) via β-lactamase activiteit in de gastheercel cytoplasma (Figuur 1). Het gen van belang wordt gefuseerd aan TEM-1 β-lactamase (BLAM) op een reporterplasmide die constitutieve expressie verschaft. De BLAM substraat bestaat uit twee fluoroforen (coumarine en fluoresceïne), die een FRET-paar vormen. Excitatie van de cumarine in FRET resultaten van het fluoresceïne en groene fluorescentie-emissie in afwezigheid van effector translokatie; Indien de BlaM-effector-eiwit translocatie in de gastheer cytoplasma, de resulterende β-lactamase activiteit splitst de β-lactam ring van het BLAM substraat, het scheiden van het FRET paar producerende blauwe fluorescentie-emissie na excitatie. Deze translocatie assay is bewezen als een benadering van effector eiwitten te identificeren van een reeks verschillende intracellulaire en extracellulaire bacteriën, waaronder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropathogene E. coli, Salmonella en Brucella 17,30-35.

Om de rol van specifieke host factoren op Coxiella effector translocatie bepalen we gebruik van een bekende methode voor het gene silencing bekend als RNA-interferentie, in het bijzonder kleine interfererende RNA (siRNA). Oorspronkelijk geïdentificeerd in Caenorhabditis elegans, RNA-interferentie is een geconserveerd endogeen cellulair proces dat wordt gebruikt voor het aangeboren defense tegen virussen en genregulatie 36,37. Na binding van sequentie-specifieke siRNA, afbraak van mRNA vindt plaats via RISC (RNA-geïnduceerd silencing complex) waardoor specifiek gen silencing of 38 knockdown. In deze studie werd gebruikt siRNA targeten twee gastheereiwitten, Rab5A en Rab7A, die belangrijke regulatoren van de endocytische route zijn. De impact van zwijgen Rab5A en Rab7A op effector translocatie werd vastgesteld met behulp van C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 werd geselecteerd als zij eerder werd aangetoond dat getransloceerd door de Dot / Icm secretie systeem van Coxiella 17.

Gebruik makend van beide siRNA gene silencing en de fluorescencebased translocatie test hier beschreven, beginnen we een rol voor host factoren te vestigen in de translocatie van effector eiwitten door Coxiella. Deze benadering kan worden toegepast op een breed scala aan zowel intracellulaire als extracellulaire bacteriën die vergelijkbaar secretio bezittenn systemen verantwoordelijk voor de translocatie van effector eiwitten.

Protocol

Opmerking: Alle procedures met betrekking tot de groei of manipulatie van Coxiella burnetii RSA439 NMII moeten worden uitgevoerd in een Physical Containment Level 2 Laboratorium en binnen een biologische veiligheid kast in overeenstemming met de plaatselijke richtlijnen. Een schematisch diagram van de reverse transfectie en translocatie assay workflow hierna beschreven wordt getoond in figuur 2. 1. Bereiding van C. burnetii Cultuur uitdrukken CBU0077 gefuseer…

Representative Results

Voor deze studie, de C. burnetii pBlaM CBU0077-stam werd geselecteerd als CBU0077 Eerder is aangetoond een translocatie effector van Coxiella Dot / Icm secretiesysteem 17 zijn. Vóór infectie, het totale aantal genomen / ml in de zeven dagen C. burnetii pBlaM-CBU0077 kweek werd geteld middels qPCR. Figuur 4 toont een voorbeeld van de cyclus drempelwaarde (Ct) waarden verwacht beide standaarden en monsters na qPCR. De Ct-waarden (gra…

Discussion

Secretiesystemen, en de bacteriële effector eiwitten deze transportsystemen in het cytoplasma van gastheercellen, zijn een belangrijke virulentie onderdeel dat vele pathogene bacteriën gebruiken om een ​​infectie in unieke replicatieve niches stellen. De focus van veel onderzoeksgroepen is om de interactie tussen bacteriële effectoren en gastheer- en de invloed van deze effectoren hebben voor talrijke cellulaire routes onderzocht. Zeer weinig onderzoek, eventueel, de mogelijkheid van gastheereiwitten noodzakelijk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Materials

Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5X siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Play Video

Cite This Article
Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

View Video