We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
Антитела изотипа IgM демонстрируют большой терапевтический потенциал для лечения различных заболеваний , в том числе рака и заболеваний ЦНС 1-7. Группа The Vollmers "выявили многочисленные антител у больных раком для возможного использования в качестве специфичных к опухоли биомаркеров или активных терапевтических средств , которые способны убивать раковые клетки путем индукции апоптоза путей 4,8,9. Интересно, что все выявленные антитела с терапевтическим потенциалом являются изотип IgM и принадлежат к группе "естественных аутоантител" (NABS).
Кроме того, группа Родригес идентифицировала мышь и человеческие антитела, которые стимулируют ремиелинизацию при хроническом демиелинизированных поражения спинного мозга в моделях рассеянного склероза (РС). Идентичный антител с противораковым действием, все ремиелинизации стимулирующие антитела являются NABS и изотип IgM 1,6,7,10. Точные антигены для большинства выявленных IgMs все еще undetermined включая человеческий ремиелинизацию-продвижение антитела rHIgM22, в настоящее время в фазе I клинических испытаний для пациентов с рассеянным склерозом 11. Несмотря на неоднократные усилия специалистов в области липидного и углеводного исследований как в академических кругах , так и в партнерстве с промышленностью 11, предпринимается попытка выявить антиген rHIgM22, не были успешными. Провал стандартных методов, используемых для выявления антигенов IgG антител к работе с IgM антител определяет критическую необходимость уточнения методов, специфичных для этих антител, которые наиболее вероятной мишенью углеводные или липидные антигены.
В центре внимания этой рукописи является человеческое антитело регенеративная HIgM12 и экспериментальные процедуры, используемые для идентификации его антиген. Антитело HIgM12 был идентифицирован у пациентов с макроглобулинемией Вальденстрема, стимулирует рост невритов в пробирке 12-14 и цели полисиаловая кислоты (PSA) , прикрепленную к нейронной молекулы клеточной адгезии (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 продлевает срок службы в модели мыши БАС 17 и улучшает функциональные результаты в мышиной энцефаломиелит вируса Theiler ( в TMEV) -infected мышей. В частности, HIgM12 стимулирует спонтанную горизонтальной и вертикальной двигательной активности в хронически демиелинизированных мышей и увеличивает числа малого и среднего диаметра спинного мозга аксонов через восемь недель после того, как один, низкая доза внутрибрюшинного вводили антитела 18.
Нервный молекула клеточной адгезии (NCAM) представляет собой гликопротеин иммуноглобулина (Ig) суперсемейства экспрессируется на поверхности клеток нейронов, глии, скелетных мышцах, и естественных клеток – киллеров 19-25. Три основных NCAM изоформы называются NCAM180, NCAM140 и NCAM120, альтернативные варианты сплайсинга первичного транскрипта, которые различаются только в своем цитоплазматическом домене. В ЦНС, NCAM является основной Полисиалилированный молекулы (> 95%) с длинными, отрицательно заряженные гомополимеров сиаловой кислоты. полисиаловаячид с п> 10 называется PSA, но существуют более короткие олигомерные структуры, которые также являются биологически значимым. Другие Полисиалилированный белки , выраженные в ЦНС являются SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 и субъединица натриевых каналов 25 (для обзора см 29).
Методы , описанные здесь , позволяют идентифицировать антиген для иммуноглобулинов человека и мыши , содержащих специфические каппа (Vκ) легкие цепи (VκI, VκIII или VκIV легкие цепи для антител человека и VκI легких цепей антител мыши) независимо от того, изотип антитела (например, IgG, IgM , IgA, IgD или IgE). Это ограничение основано на использовании белка L агарозы для иммунопреципитации с антителами изотипа IgM. Альтернативные стратегии могут включать маннозы-связывающие лектины и вторичные антитела IgG анти-IgM, ковалентно связанные с агарозном шарики, которые могут расширить применимость этого метода к большему количеству антител класса IgM в т.ч.ЛУДИНГ те с лямбда (λ) легкой цепей (обсуждение см). Соотношение сывороточных легких цепей IgM Vκ по сравнению с IGM Х легких цепей , полученных от здоровых людей составляет 1,5: 1 30.
На основе хроматографического методологии , используемой здесь , чтобы разделить, обогатить и иммунологически обнаруживать определенные молекулы 31, все антигены должны включать , по меньшей мере , один небольшой домен белка. Специфического связывания с антителом эпитоп может находиться в пределах или за пределами домена белка (например, в гликопротеины, липопротеины). Первоначальные биохимические шаги, используемые для идентификации специфического антигена для HIgM12, соответствующий, чтобы сузить список потенциальных кандидатов, являются наиболее важными шагами в этом методе. типа клеток специфических препаратов и морфологии клеток на основе характеризации описаны для глиальных клеток, но эта методика может быть экстраполированы, чтобы приспособить другие типы клеток внутри или за пределами центральной нервной системы.
Существует настоятельнаянеобходимо разработать новые или измененные методы, применяемые для увеличения количества IgM антител с терапевтическим потенциалом для различных заболеваний у человека и особенно в тех случаях, (большинство антигенов IgM), где антитело цели являются углеводные или липидные структуры.
Человеческие естественные аутоантитела класса IgM являются привлекательными кандидатами на иммунотерапии и продемонстрировали терапевтический потенциал для лечения различных заболеваний , в том числе рака и заболеваний ЦНС 1-7. Предпочтительно, чтобы эти антитела не будут вызывать иммунный ответ, в котором генерирование нейтрализующих антител существенно снижает эффективную терапевтическую дозу и эффективность. Важно то , что все антитела с терапевтическим потенциалом были изотип IgM и принадлежат к репертуара NAB 3-5,8,9,37,40,42-45. Главным препятствием для потенциального клинического применения IgM антител является идентификация их антигенов, которые неопределенных во многих случаях. Стандартные методы, используемые для IgG антител, часто не применяется для выявления антигена в IGM не давал.
Этот протокол описывает идентификацию PSA-NCAM в качестве антигена для регенеративной человеческого антитела IgM HIgM12, эффективное в животных моделяхРС и БАС 15-18. Методология, используемая применимую для всех человеческих антител со специфическими Vκ легких цепей VκI, VκIII и VκIV и мышиных антител с легкими цепями VκI, независимо от того, изотип антитела.
Самым важным шагом в этом протоколе является использование антител класса IgM в сродства применения хроматографии. Более конкретно, успешные антитела должны действовать в качестве ниспадающих агентов в иммунопреципитации, чтобы изолировать или обогатить антиген из сложных ткане или клеточных культур лизатов. Обогащенные фракции антигена можно сравнить с иммунопреципитации из-под контроля изотипа антител и затем анализировали на различия масс-спектрометрией. Одним из важнейших требований или ограничений данного шага является наличие антител правильно Vκ легкой цепи и хозяина (человека, мыши), чтобы позволить связывание с белком L агарозы антитела. Использование маннан-связывающего белка, связанного с агарозой (также Каллеd манноза-связывающий лектин) вместо белка L агарозы является потенциальной альтернативой иммунопреципитации IgMs без конкретных легких цепей Vκ. Тем не менее, как заявил Арнольд и др. , 35, антиген-связанный IgM антитела не связываются с маннан-связывающего белка, как и появляются мишени Гликан стать недоступными , как только IgM , связала со своим антигеном. На основании этих данных маннан-связывающего белка , не может быть использован в качестве связующей матрицы для иммунопреципитации антиген загруженным IgM – молекулы 35. Другие потенциальные альтернативы могут быть использование вторичных агарозном переплете анти-IgM , IgG антител 46,47 или использованием поверхностно-активированных магнитных гранул 48. IgG-антитела, направленные против IgMs могут быть химически сшиты агарозном или агарозном G, с тем чтобы уменьшить степень элюированного антитела вместе с представляющим интерес антигеном. Правильное сравнение между различными вариантами IgM иммунопреципитации относительно успешно выявленных антигенов яS трудно, потому что большинство иммунопреципитации были выполнены, чтобы изолировать или истощить IgMs без дальнейшего интереса к их антигенов. Кроме того, иммунопреципитации с использованием IgMs в основном использовались для подтверждения уже известных или предполагаемых одного антигена с воздействием антитела к очищенных антигенов 49. Недостатком агарозном связью IgGs направлено против человеческого IgMs является очень низкий выход (10 – 15%) от иммуноосажденного сыворотки молекул IgM, по сравнению с исходным материалом 50. В противоположность этому , поверхностно-активированный магнитные шарики были успешно применены к антител различных изотипов , включая IgM к иммунопреципитации скрепи-ассоциированных фибрилл 48. Этот метод не ограничивается конкретной каппа (Vκ) или лямбда (λ) цепей или конкретного хозяина и может существенно расширить спектр IgM антител, используемых в иммунопреципитации.
Еще одним важным шагом в протоколе является способность антитела функционировать как DETантитела (выполнения над каждым первичным антителом) в Вестерн-блоттинга или других скрининговых платформ. Успешные антитела должны быть направлены на их антиген с достаточно высокой степенью сродства, чтобы позволить связывания антигена в присутствии неионных или, возможно, ионных детергентов. Высокоаффинных антител распространены среди аффинно созрела IgG антител, но менее распространены среди антител изотипа IgM, которая является одной из причин, почему существует относительно небольшое число коммерчески доступных антител IgM в качестве детектирующего агентов в биохимических параметрах. Высокое сродство связывания антител является обязательным требованием для иммунопреципитации молекулярных антигенов и для вестерн-блоттинга. Снижение концентрации моющего средства или полное отсутствие моющих средств в буферах IP и лизиса буферов позволяет антиген Таргетинг по низким сродством антител с помощью своей области Fab. В противоположность этому, способность антитела к белку-мишени L агарозы с помощью своей части Fc не существенно влияет среди элементов управления изотипных в диапазоне различных концентра моющих средствнистрации. Тем не менее, низкая концентрация детергента в буфере для лизиса и буфер IP предотвращает разрушение клеточных мембран и выделение специфических молекул. Аналогичным образом , при низкой концентрации моющего средства в Вестерн – блот – моечных буферами (например, PBS-T) позволяет связывания антигена из низкоаффинных антител , но в то же время увеличивает неспецифическое связывание и поэтому не вариант.
Присутствие корового антигена белка является еще одним требованием для этого метода. Белки с посттрансляционных модификаций (например, гликопротеины, липопротеины) и немодифицированных белков, но не единственными липидов или углеводов, могут быть обнаружены в Вестерн – блоттинга. Это не представляется возможным иммунопреципитации липиды (например, сфинголипидов) из ткани или клеточных лизатов в присутствии или в отсутствие моющих средств. Физико-химические свойства моющих средств и липидов слишком похожи, чтобы позволить селективные липидные-антитело взаимодействий, в то время как в то же самое время, моющие средства имеют важное значение для разрушенияМембраны для того, чтобы обеспечить селективное выделение специфических молекул. Насколько нам известно, иммунопреципитации исключительно состоящих из углеводов, в отсутствие белкового ядра, не сообщалось ранее. Это становится особенно актуально, так как IgM-антител часто целевых углеводы и гликолипиды, которые не обязательно связаны с блоком белка. Другие хроматографические методы, необходимые для разделения и иммунологической идентификации липидов и углеводов в отсутствие белкового ядра. Например, при тонкослойной хроматографии (ТСХ) , клеточных липидов с последующим детектированием антителом на ТСХ пластине (иммуно-ТСХ) может быть реализовано 51,52.
Другие антитела анти-PSA были описаны в предыдущих исследованиях и результаты по сравнению с HIgM12, а также коммерчески доступного анти-PSA IgM (клон 2-2b). Наиболее часто используемым антителом в области PSA представляет собой IgG-антитела (клон 735) доступны в качестве monoc мышиlonal или поликлональное антитело кролика 53. Это антитело анти-PSA IgG обнаруживает PSA на SynCAM и NCAM на различных типах клеток , включая ЦНС клеток микроглии 41. В отличие от антител анти-ПСА IgG, антитела IgM человека HIgM12, HIgM42 и анти-мышиных IgM-PSA (клон 2-2b) не могут предназначаться PSA на SynCAM (но на NCAM) в различных эмбриональных и раннего постнатального стадии у мышей , в то время как не-Полисиалилированный SynCAM легко обнаруживается 15. Антитела класса IgM используются также не в состоянии обнаружить PSA на клетках микроглии (рис 3 + 4). Возможное объяснение различий наблюдается между изотипов антител могут быть низкие уровни PSA-SynCAM по сравнению с уровнями PSA-NCAM в сочетании с потенциально более низким сродством связывания IgM антител по сравнению с анти-PSA IgG. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели иммунопреципитации в NCAM KO животных на эмбриональной стадии E17 с огромным количеством SynCAM настоящее время и используется HIgM12 как "спускающее агент" <SUP> 15. В E17 WT однопометница управляет HIgM12 иммуноосажденного PSA-NCAM до такой степени, что показали аналогичные интенсивности "разобрали" PSA-NCAM по сравнению с IgMs тяжелой цепи, обнаруженной с помощью денситометрии в последующем Вестерн-блоттинга с использованием элюированных антигенов. Этот результат предложил, по крайней мере достаточное сродство HIgM12 к целевой PSA. В отличие от WT однопометница управления HIgM12 не обнаружили PSA прикрепленный к SynCAM в NCAM KO животных. Идентичные результаты были получены в иммунопреципитации с использованием человеческого анти-PSA IgM HIgM42. HIgM12 и HIgM42, а также мышиное анти-ПСА IgM (клон 2-2b) не могли предназначаться PSA на SynCAM в Вестерн-блоттинга от WT и NCAM KO животных на эмбриональных и постнатальных стадиях развития. Учитывая низкое количество HIgM12 требуемого (0,1 мкг / мл) для специфического определения PSA , прикрепленную к NCAM в вестерн – блоттинга с использованием небольших количеств ткани ЦНС (0,1 мкг ЦНС ткани на лунку) 15 оно , как представляется, маловероятно , что только низкие аффинностиответственность за полное отсутствие обнаружения ПСА-SynCAM по HIgM12 в трех различных методов.
Мы пришли к выводу, что существуют значительные различия между анти-PSA антитела IgM и часто опубликованной анти-PSA IgG антитела (клон 735). Не ясно, почему коммерчески доступные антитела анти-PSA IgM не использовались чаще в прошлом, чтобы подтвердить результаты, полученные с помощью antiPSA IgG антитела 735. Это особенно интересно, потому что HIgM12 уже доказала свою эффективность в различных моделях болезни. В то время как другие анти-PSA антитела IgM могут иметь сходные терапевтические эффекты, остается неясным, имеет ли анти-PSA IgG антитела (клон 735) аналогичный терапевтический результат в моделях MS и ALS.
Короче говоря, методы, описанные здесь, были использованы в первую очередь для определения антигена регенеративных HIgM12 человеческого антитела для поддержки потенциальных клинических испытаний для РС и, возможно, других нейродегенеративных заболеваний. Идентификация муравейigens для антител с биологической активностью как существенный шаг, чтобы понять их механизм действия. Это становится особенно актуальным в контексте многочисленных моноклональных антител в настоящее время тестируется на безопасность и эффективность в испытаниях на людях. В то время как число клинически протестированных IgM антител к настоящему времени мало, последние достижения в гибридомной технологии вместе с увеличением числа исследований , освещающих терапевтический потенциал этого класса антител 1-10,37,40,42-45 призывает разработку новых или модифицированные методы, применяемые для идентификации небелковых антигенов IgM.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (R01 GM092993, R01 NS048357 и R21 NS073684), Национальный научный фонд (премии КАРЬЕРА), премии Миннесота партнерства в области биотехнологии и медицинской геномики, Национальный общества рассеянного склероза (CA1060A) и Mayo Clinic Центр клинической и поступательной науки (CCATS). Авторы признают поддержку со стороны Эпплбаум, Hilton, Петерсон и Sanford Фундаменты, Луны и Мэрилин фонда Парк директорства и семьи McNeilus.
DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |