We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
的IgM同种型的抗体表现出对各种疾病的治疗包括癌症和CNS障碍1-7大的治疗潜力。该Vollmers“组确定癌症患者大量抗体作为肿瘤特异性标志物,或者能够通过诱导凋亡途径4,8,9杀死恶性细胞活跃疗法的潜在用途。有趣的是,具有治疗潜力的所有确定抗体是IgM同种型的和属于该组的“天然抗体”(NAb的)的。
同样地,罗德里格兹的组识别鼠标和在多发性硬化症(MS)的模型刺激髓鞘慢性脱髓鞘脊髓病变的人抗体。相同的具有抗癌作用的抗体,所有的髓鞘再生,促进抗体的NAb和IgM同种型1,6,7,10的。对于大多数鉴定的IgM精确的抗原仍然undetermined包括MS患者11 I期临床试验的人的髓鞘再生,促进抗体rHIgM22,目前在阶段。尽管在脂类和碳水化合物研究的无论是在学术环境中,并与工业11合伙领域的专家多次努力,试图确定rHIgM22的抗原都没有成功。的用于识别IgG抗体的抗原与IgM抗体工作的标准技术故障标识关键需要改进特异于这些抗体,最有可能的目标碳水化合物或脂质抗原的方法。
这份手稿的重点是人的再生抗体HIgM12以及用于识别其抗原的实验程序。抗体HIgM12从患者瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症鉴定,刺激体外 12-14神经突增生和目标连接到神经细胞粘附分子(PSA-NCA聚唾液酸(PSA)的M)15,16。 HIgM12延伸在ALS 17的小鼠模型中的寿命,并提高在Theiler鼠脑脊髓炎病毒(TMEV) -感染的小鼠的功能结果。具体地说,HIgM12刺激中小直径脊髓轴突8周慢性脱髓鞘小鼠和增加号码自发的水平和垂直运动活性后腹腔内的一个单一的,低剂量注射抗体18。
神经细胞粘附分子(NCAM)是免疫球蛋白(Ig)的神经元,神经胶质,骨骼肌,和自然杀伤细胞19-25的细胞表面上超家族表达的糖蛋白。三大NCAM亚型称为NCAM180,NCAM140和NCAM120,是一个主要的转录物的可变剪接变体,只有在其细胞质区域发生变化。内的中枢神经系统,NCAM是主要的唾液酸分子(> 95%),长的,带负电荷的唾液酸的均聚物。多聚一CID具有n> 10被称为PSA但较短的寡聚结构存在,同时也是生物相关。在中枢神经系统表达其他唾液酸蛋白SynCAM1 26,神经毡蛋白-2(NRP-2)和27,28钠通道亚基25(综述见29)。
这里所描述的方法允许含特定卡帕(Vκ)轻链(对于人抗体和VκI轻链为小鼠抗体VκI,VκIII或VκIV轻链)人和小鼠免疫球蛋白的抗原识别而不管抗体的同种型( 例如,IgG抗体,IgM抗体的,IGA,IgD的或IgE)。这种限制是基于使用蛋白L琼脂糖的用于与IgM同种型的抗体免疫沉淀。替代策略可以包括甘露糖结合凝集素和共价连接到琼脂糖珠次级IgG抗IgM抗体,其可以扩大该方法的适用性更IgM抗体增量泸定那些拉姆达(λ)轻链(见讨论)。相比IgM抗体λ健康个体衍生轻链的IgM血清轻Vκ链的比率是1.5:1 30。
基于此处用来分离,富集和免疫检测特定分子31的色谱方法,都需要所有抗原包括至少一种小的蛋白质结构域。该抗体的特异性结合的表位可以是内部或蛋白质结构域( 例如 ,在糖蛋白,脂蛋白)的外部。用于识别特定抗原HIgM12,各自以缩小潜在候选的列表中最初的生化步骤,是在该方法中最关键的步骤。细胞类型特异性制剂和基于细胞形态学-表征为神经胶质细胞被描述,但该方法可以外推到容纳内或中枢神经系统以外的其它类型的细胞。
目前迫切需要开发适用于数量的增加,其中所述抗体的目标是碳水化合物或脂质结构IgM抗体与特别是在这些情况下,对于不同的人类疾病的治疗潜力(多数的IgM抗原)的新的或修改的技术。
人天然IgM抗体正在呼吁免疫疗法的候选人,并已显示出对各种疾病的治疗包括癌症和中枢神经系统疾病1-7治疗潜力。有利的是,这些抗体不会引起免疫反应,其中的中和抗体的产生显着减少的有效治疗剂量和疗效。重要的是,具有治疗潜力的所有抗体一直是IgM同种型的并且属于NAB剧目3-5,8,9,37,40,42-45。为潜在的临床应用的IgM抗体的一个主要障碍是其抗原,它们在许多情况下,未确定的识别。对于IgG抗体采用标准技术通常并不适用于识别的IgM的抗原。
这个协议描述PSA-NCAM的识别作为抗原的再生人IgM抗体HIgM12,有效的动物模型MS的和ALS 15-18。所采用的方法主要适用于特定Vκ轻链VκI,VκIII和VκIV和鼠标与抗体轻VκI所有连锁人类抗体,而不论该抗体的同种型。
在这个协议中最关键的一步是在亲和层析应用中使用IgM抗体。更具体地,需要成功的抗体作为下拉剂免疫沉淀来分离或富集抗原出复杂的组织或细胞培养裂解物。富集抗原馏分可以进行比较,以从同种型对照抗体免疫沉淀,并随后分析通过质谱法的差异。一个基本要求或该步骤的限制是正确的抗体Vκ轻链和主机(人,小鼠)的存在下,使抗体结合到蛋白L琼脂糖。结合到琼脂糖甘露聚糖结合蛋白的用途(也卡勒Ð甘露糖结合凝集素),而不是蛋白质L琼脂糖是免疫沉淀的IgM没有具体Vκ轻链的潜在替代。然而,如由阿诺德等人 35所述,结合抗原的IgM抗体不结合甘露聚糖结合蛋白,作为目标聚糖似乎变得不可访问一旦IgM抗体已结合至其抗原。基于这些发现甘露聚糖结合蛋白,不能使用作为结合基质免疫沉淀负载抗原的IgM的分子35。其他潜在的替代品可能是利用二次琼脂糖结合的抗IgM IgG抗体46,47或使用表面活化磁珠48。针对的IgM IgG抗体可能是化学交联琼脂糖A或琼脂糖的G以与感兴趣的抗原一起减少洗脱抗体的程度。 IgM抗体免疫沉淀的不同种类之间的适当的比较就成功识别抗原的我因为大多数免疫沉淀进行隔离或耗尽的IgM没有在他们的抗原进一步加息很难。此外,使用的IgM免疫沉淀主要用来确认用抗体暴露于纯化的抗原49的已知的或预期的单一抗原。相比于原料50时免疫沉淀血清的IgM分子- (15%10)针对人的IgM琼脂糖偶联的IgG的一个缺点是一个非常低的产率。与此相反,表面活化磁珠成功地应用于不同的同种型包括IgM免疫沉淀瘙痒相关纤维48的抗体。此方法并不限于特定卡伯(Vκ)或lambda(λ)链或特定宿主,并且可以基本上扩大在免疫沉淀中使用IgM抗体的频谱。
在协议中的另一个重要步骤是该抗体的以用作DET能力阿拉斯在Western印迹或其他筛选平台抗体(初级抗体)。成功的抗体必须定位它们的抗原以足够高的亲和力,以允许抗原在非离子型或可能离子洗涤剂的存在下的结合。高亲和力抗体是亲和熟化IgG抗体中常见,但在IgM同种型,这就是为什么有相对少的市售IgM抗体作为生化设置检测剂的原因之一的抗体中不常见的。高亲和力抗体的结合是对分子的抗原的免疫沉淀反应和Western印迹的一个要求。降低洗涤剂浓度或完全不存在于IP缓冲液和裂解缓冲液的洗涤剂允许抗原通过其的Fab结构域由低亲和力抗体定位。相反,抗体的经由其Fc部分靶向蛋白L琼脂糖能力基本上不同种型对照中受影响的范围内不同的洗涤剂concen的trations。然而,在裂解缓冲液和IP缓冲器低洗涤剂浓度防止细胞膜破坏和特定分子的分离。同样地,在Western印迹洗涤缓冲液低洗涤剂浓度( 例如,PBS-T)允许抗原低亲和力抗体的结合,但在同一时间增加的非特异性结合,因此不是一种选择。
抗原蛋白质核的存在是该方法的另一要求。用翻译后修饰( 例如 ,糖蛋白,脂蛋白)和未修饰的蛋白质,但并非唯一的脂质或碳水化合物的蛋白质,是在Western印迹检测到。这是不可能的,以免疫沉淀从组织或细胞裂解物的脂质( 例如,鞘脂)在洗涤剂中的存在或不存在。洗涤剂和脂质的物理化学性质是太相似,以允许选择性脂质 – 抗体相互作用,而在同一时间清净剂是必不可少的扰乱为了膜可以允许特定分子的选择性分离。据我们所知,免疫沉淀仅仅包括碳水化合物,在不存在的蛋白质核心的,还没有被报道。因为IgM抗体频繁目标碳水化合物和糖脂,这是没有必然联系的蛋白质单元这一点变得尤其重要。其他色谱技术都需要分离和免疫学鉴定脂质和碳水化合物在没有蛋白质核的。例如,在TLC板(免疫TLC)与随后抗体检测细胞脂质的薄层色谱法(TLC)可以实现51,52。
其他抗PSA抗体已在以往的研究和结果进行了描述比较了HIgM12以及市售抗PSA的IgM(克隆2-2B)。在PSA领域中最常用的抗体可作为小鼠monoc IgG抗体(克隆735)lonal或兔多克隆抗体53。此抗PSA IgG抗体检测的PSA上SynCAM和NCAM上不同的CNS细胞类型,包括小胶质细胞41。与此相反的抗PSA IgG抗体,人IgM抗体HIgM12,HIgM42和抗PSA小鼠IgM(克隆2-2B)无法定位到SynCAM PSA(但NCAM)在小鼠各种胚胎和出生后早期阶段,非唾液酸SynCAM是容易检测15。所使用的IgM抗体也不能检测在小神经胶质细胞( 图3 + 4)的PSA。相比具有潜在的较低的亲和力相比,抗PSA抗体的IgM抗体的结合组合PSA-NCAM水平抗体同种型之间观察到的差异的可能解释可以是低的PSA SynCAM水平。为了检验这一假设,我们与大量SynCAM目前的执行中NCAM KO动物免疫沉淀在胚胎阶段E17和使用HIgM12作为“下拉代理”<SUP> 15。在E17 WT同窝控件HIgM12免疫沉淀PSA-NCAM到的程度,即显示出的“拉下”PSA-NCAM相比通过使用洗脱抗原随后印迹光密度检测出的的IgM重链相似的强度。这一结果表明,至少HIgM12有足够的亲和力,它的目标PSA。在对比WT同窝控制HIgM12没有检测附着到SynCAM在NCAM KO动物的PSA。相同的结果是使用人类抗PSA的IgM HIgM42在免疫沉淀得到的。 HIgM12和HIgM42,以及小鼠抗 – PSA IgM抗体(克隆2-2B)无法定位在胚胎和出生后的发育阶段从WT和NCAM KO动物印迹上SynCAM粘合剂。定所需HIgM12的低量(0.1微克/毫升),以特异性检测附着到NCAM在使用少量CNS组织(每孔0.1微克CNS组织)的Western印迹的PSA 15这似乎是不可能的,低亲和力单独是负责三种不同的方法完全缺乏PSA-SynCAM检测由HIgM12。
我们的结论是有抗PSA IgM抗体和频频发布抗PSA IgG抗体(克隆735)之间的显著差异。为什么市售抗PSA IgM抗体未在过去更频繁地使用,以确认与antiPSA IgG抗体735所获得的结果,因为HIgM12已经在不同的疾病模型已经证明效力,这是特别有趣的,目前尚不清楚。而其它抗PSA IgM抗体可以具有类似的治疗效果仍然不清楚的抗PSA IgG抗体(克隆735)是否具有在MS和ALS模型类似的治疗效果。
简言之,此处所描述的方法主要被用于识别再生人抗体HIgM12的抗原,以支持用于MS的潜在的临床试验和其他可能的神经变性疾病。蚁的识别为具有生物活性的抗体igens是了解其作用机理是必不可少的步骤。这成为在目前正在为在人体试验安全性和有效性进行测试大量的单克隆抗体的情况下特别相关。而临床测试IgM抗体迄今为止的数目是小的,最近在杂交瘤技术,越来越多的研究突出该抗体类1-10,37,40,42-45的治疗潜力一起进步促使新的或开发改性方法适用于鉴定非蛋白质的IgM抗原。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由卫生(R01 GM092993,R01 NS048357和R21 NS073684)全国学院的资金支持,美国国家科学基金会(CAREER奖),明尼苏达州合作奖的生物技术和医学基因组学,国家多发性硬化症协会(CA1060A)和梅奥诊所中心的临床和转化科学(CCATS)。作者承认从阿普尔鲍姆,希尔顿,彼得森和桑福德基金会,月球和玛丽莲公园出任董事基金和McNeilus家人的支持。
DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |