Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
Bu protokol, 2'-alkin sentezi için bir yöntem olup, standart fosforamidit kimyası kullanılarak otomatik katı faz sentezi ile deoksiribonükleik asit (DNA) ipliklerini modifiye göstermektedir. Oligonükleotidler sonrası sentetik bakır katalize tıklama kimyası kullanılarak iki yeni ışığa siyanin boyalar ile etiketlenir. Her iki verici ve alıcı boya sentezi tarif edilir ve art arda üç aşamada gerçekleştirilir. Onlar melezleme yoluyla yakın getirildiğinde çevreleyen mimari DNA ile, bu iki boyalar bir enerji transferi uğrar. Bu nedenle, iki tek zincirli DNA şeritlerin tavlama flüoresan renk değişikliği ile görüntülenir. Bu renk değişimi, flüoresan spektroskopisi ile karakterize değil, aynı zamanda, doğrudan bir el ultraviyole (UV) lambası kullanılarak gözlemlenebilir. Çift floresan renk okuma kavramı bu oligonükleotid probları moleküler görüntüleme, özellikle açıklanan pho için mükemmel araçlar yapartostable boyalar kullanılır. Böylece, görüntüleme sondaları ışıkla ağartma önlenir ve biyolojik işlemler daha uzun bir zaman süresi için, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.
Introduction
Moleküler görüntüleme canlı hücrelerin içinde biyolojik süreçleri anlamak için temel bir tekniktir. 1-3 gibi kimyasal-biyolojik uygulamalar için floresan nükleik asit bazlı prob geliştirilmesi genişleyen bir araştırma alanı haline gelmiştir. Bu floresan sondalar hücre görüntüleme için uygun araçlar haline birkaç gereksinimlerini karşılamak gerekir. İlk olarak, uygulanan boya yüksek kuantum verimleri ile floresan sergilemelidir büyük Stokes kaymalar ve en önemlisi, yüksek photostabilities in vivo görüntüleme uzun süreli izin vermek. Ve ikincisi, onlar güvenilir bir floresan okuma göstermelidir. Konvansiyonel kromofor-söndürücü sistemler floresan yoğunlukları basit değişikliklerle tek bir floresan renk okuma dayanmaktadır. 4 Bu yaklaşım nedeniyle hücre içi bileşenleri veya düşük sinyal-gürültü oranları otofloresansı yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçların riskini taşımaktadır nedeniyle diğer com tarafından istenmeyen soğutulması içinTüm unsurların. 4
Biz son zamanlarda iki farklı kromoforlar kullanarak ikili floresan renk okumalarını gösteriyor "DNA trafik ışıkları" kavramına bildirildi. 5-6 kavramı floresan değiştirir alıcı boyasına donör boya enerji transferi (ET) dayanmaktadır renk (Şekil 1). Bu daha güvenli bir okuma sağlar ve bu şekilde flüoresan görüntüleme sondaları için güçlü bir araç sunar. floresan boyalar ile oligonükleotid Etiketleme iki farklı yaklaşım ile elde edilebilir. Boyalar mukabil değiştirilmiş fosforamidit yapı taşları kullanılarak bir katı faz üzerinde, kimyasal DNA sentezi sırasında dahil edilebilir. 7, bu yöntem, standart fosforamidit ve koruma kaldırma koşulları altında stabil olan boyalar ile sınırlıdır. Bir alternatif olarak, sentez sonrasında modifikasyon yöntemleri oligonükleotid kimyasında kurulmuştur. Burada, bizim yeni Fotoğrafların birinde sentezini göstermekmasa enerji transferi çiftleri 8,9 ve azidler ve alkinlere (CuAAC) arasındaki bakır katalize 1,3-sikloadisyon kullanılarak DNA'nın sonrası sentetik etiketleme. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol azid modifiye floresan boyalar ile CuAAC aracılığıyla DNA sonrası sentetik etiketlemek için tam bir işlemi göstermektedir. Bu boyalar ve alkin ile modifiye edilmiş DNA sentezini ve etiketleme işlemi içermektedir.
Boyaların sentezi dört adımları izler. Tüm ürünler nedeniyle pozitif yük için oldukça basit bir çökeltme ile elde edilebilir ve zaman alıcı kolon kromatografisi gereklidir. merkezi bağlantı adımlar önce azid işlevleri tanıtımı dört yerin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, 1386 / 17-1 Wa) tarafından finansal destek Araştırma Eğitim Grubu (DFG tarafından finanse edilen) GRK 2039 ve KIT minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
