Синтез Длина волны сдвига ДНК гибридизационных зондов с помощью фотостабильным цианиновыми Красители
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
В этом протоколе, мы демонстрируем метод синтеза 2'-алкине модифицированный дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), прядей с помощью автоматизированного твердофазного синтеза с использованием стандартной химии фосфорамидитов. Олигонуклеотиды после синтетически помечены двумя новыми фотостабильных красителей цианиновыми с использованием медно-катализируемой щелчка химии. Синтез обоих донора и акцептора красителя описывается и выполняется в ходе трех последовательных стадий. С помощью ДНК в качестве окружающей архитектуры, эти две краски претерпевают передача энергии, когда они приводятся в непосредственной близости от гибридизации. Таким образом, отжиг двух одноцепочечных цепей ДНК визуализируют с помощью изменения цвета флуоресценции. Это изменение цвета характеризуется флуоресцентной спектроскопии, но можно также наблюдать непосредственно с помощью портативных ультрафиолетового (УФ) лампы. Концепция двойной флуоресценции цвета считывания делает эти олигонуклеотидных зондов отличные инструменты для молекулярной визуализации, особенно когда описывается фоиспользуются tostable красители. Таким образом, фотообесцвечивание зондов изображений предотвращается, и можно наблюдать биологические процессы в режиме реального времени, в течение более длительного периода времени.
Introduction
Молекулярная визуализация представляет собой фундаментальный метод для понимания биологических процессов в живых клетках. 1-3 Развитие флуоресцентных зондов нуклеиновых кислот , основанных на таких химико-биологических приложений стало расширение полевых исследований. Эти флуоресцентные зонды должны соответствовать ряду требований, чтобы стать подходящими инструментами для визуализации клеток. Во – первых, применяемые красители должны проявлять флуоресценцию с высоким квантовым выходом, сдвиги больших Стокса и, самое главное, высокие photostabilities , чтобы в долгосрочной перспективе в естественных изображений. А во-вторых, они должны показать надежную флуоресцентного считывания. Обычные хромофор-гасителем-системы основаны на считывании одного цвета флуоресценции простыми изменениями в интенсивности флуоресценции. 4 Этот подход несет риск ложных положительных или ложных отрицательных результатов вследствие автофлюоресценции внутриклеточных компонентов или низким отношением сигнал-шум из-за нежелательного тушения другой комненты. 4
Недавно мы сообщали о концепции "светофоров ДНК" , которые показывают двойной флуоресценции цвета отсчеты с помощью двух различных хромофоров. 5-6 Концепция основана на передаче энергии (ET) от донора красителя к акцепторной краситель , который изменяет флуоресценции цвет (рисунок 1). Это позволяет более надежное считывание и тем самым обеспечивает мощный инструмент для визуализации флуоресцентных зондов. Этикетировочное олигонуклеотидов с флуоресцентных красителей может быть достигнуто с помощью двух различных подходов. Красители могут быть включены во время химического синтеза ДНК на твердой фазе , с использованием соответствующим образом модифицированных фосфорамидит строительных блоков. 7 Этот способ ограничен красители, которые стабильны в стандартных фосфорамидитных и удаления защитной группы условиях. В качестве альтернативы, после синтетические методики модификации были созданы в химии олигонуклеотида. Здесь мы демонстрируем синтез одного из наших новых фотографийТаблица энергии пар передачи 8,9 и пост-синтетической маркировки ДНК с использованием медно-катализируемой 1,3-циклоприсоединения между азидов и алкинов (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол показывает полную процедуру маркировать ДНК после синтетически с помощью CuAAC азидом модифицированного флуоресцентных красителей. Это включает в себя синтез красителей и ДНК алкинов-модифицированный, а также процедуры маркировки.
Синтез красителей следу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), Научно-исследовательский Training Group ГРК 2039 (финансируется DFG) и KIT выражает искреннюю признательность.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
