We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Выделение гигантских вирусов представляет большой интерес в этой новой эры вирусологии, тем более, что эти гигантские вирусы связаны с простейшими. Гигантские вирусы могут быть потенциально патогенными для многих видов протистов. Они принадлежат к недавно описанному порядку Megavirales. Новая линия Faustovirus, который был выделен из проб сточных вод является отдаленное отношение к возбудителю млекопитающих африканской чумы свиней вирусом. Этот вирус также специфическими для его amoebal хозяина, Vermamoeba vermiformis, в протисты распространены в системах здравоохранения воды. Крайне важно, чтобы продолжить выделения новых генотипов Faustovirus для того, чтобы расширить свою коллекцию генотип и изучения ее пан-геном. Мы разработали новые стратегии для выделения дополнительных штаммов путем улучшения использования антибиотиков и противогрибковых комбинаций, чтобы избежать бактериальных и грибковых загрязнений амебы сокультивирования и пользу размножение вируса. Мы также реализовали новую starvatioп среда для поддержания V. vermiformis в оптимальных условиях на наличие вирусов сокультивирования. Наконец, мы использовали поточной цитометрии, а не Микроскопическое наблюдение показало, что занимает много времени отнимает много, чтобы обнаружить цитопатогенный эффект. Мы получили два изолятов из проб сточных вод, доказывая эффективность этого метода и таким образом расширяя коллекцию Faustoviruses, чтобы лучше понять их окружение, хозяина и специфичность генетического содержания.
Открытие гигантских вирусов, особенно те, которые принадлежат к порядку Megavirales, полностью изменили мир вирусов с точки зрения размера частиц и сложности генома. Вирусы были ранее считались малые предприятия, а мимивирус явился нарушить все правила. 1 метагеномной данные свидетельствуют о вездесущность гигантских вирусов не только в среде, 2-5 , но и в организме человека. 6 Таким образом, все еще существует необходимость для поиска этих вирусов в больших масштабах. Разнообразие этих гигантских вирусов оценивали путем отбора проб не только разнообразие водной среды и связанных с ними отложений по всему миру, 7-11 , но и путем скрининга различных человеческих образцов 12,13 и проб окружающей среды. В 7,9 Polyphaga мимивирус Acanthamoeba было изолированы путем совместной культуры с помощью фагоцитоза простейших, в первую очередь Acanthamoeba SPP. 14-16 вся коллекция гигантских вирусов были тогда такжеизолированы от этого указанного протисты хозяина, который сделал научное сообщество ограничить свою исследовательскую и изолированности процедуру Acanthamoeba SPP. Ясно, что эта зависимость от одного вида хозяина привела большая часть вирусов не замечают. Тот факт , что гигантский вирус, CroV, был выделен с высоко мотильных морских простейшими кафетерия roenbergensis, 17,18 демонстрирует необходимость использования более широкого спектра простейшими для того , чтобы открыть новые клоны или семейства гигантских вирусов. Reteno и др. Удалось выбрать другой простейшими в качестве клетки хозяев , которые никогда ранее не были использованы, и выделили новый Asfar связанную происхождение гигантских вирусов (недавно названный Faustovirus). 19
В попытке выделить новые генотипы Faustovirus с целью расширения членов этого вирусного происхождения, мы изменили наши процедуры изоляции и использовали их для скрининга проб окружающей среды, способных уборки новых Faustoviruses. Мы тогдаописал весь протокол для характеристики новых изолятов. Мы оценивали Vermamoeba vermiformis, наиболее распространенный свободно живущих протисты обнаружены в человеческих условиях, 20-22 , которая уже используется в изоляции первого Faustovirus прототипа E12. 19 Этот протисты в настоящее время до сих пор у себя специфичные для Faustovirus. Мы знали, что ни один из известных вирусов гигантских был патогенным для этого амебы, потому что никакие попытки не выращивать другие вирусы гигантские в нашей лаборатории показали, амебы лизиса или вирусный рост. По этой причине мы считаем , что В. vermiformis является лучшим и самым уникальным поддержка клеток известно, выделить новые Faustoviruses.
Возможность того, что Faustovirus может быть первым членом нового семейства Megavirales близко к АЧС была впервые предложена Reteno и др., 19 , но некоторые различия все еще можно отличить. Оказывается, неясно, следует ли Faustovirus присоединиться к семье Asfarviridae или должен ли он вместо того, чт…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements to make.
LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
Plates | Cellstar | France | 655180 |
PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |