We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
בידודו של וירוסים ענקים הוא עניין רב בעידן החדש הזה של וירולוגיה, במיוחד מאז וירוסים הענקים אלה קשורים הפרוטיסטים. וירוסים ענקים עשויים להיות פתוגניים פוטנציאליים עבור מינים רבים של הפרוטיסטים. הם שייכים הסדר המתואר לאחרונה Megavirales. השושלת החדשה Faustovirus כי כבר מבודד דגימות שפכים הוא קרוב רחוק של נגיף קדחת החזירים אפריקה יונקים הפתוגן. וירוס זה הוא גם ספציפי לאותו המחשב שלה amoebal, vermiformis Vermamoeba, לפרוטיסטים נפוצים במערכות מי בריאות. זה חיוני כדי להמשיך לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להגדיל אוסף גנוטיפ שלה וללמוד הפאן הגנום שלו. פתחנו אסטרטגיות חדשות עבור הבידוד של זנים נוספים על ידי שיפור שימוש שילובי אנטיביוטיקה נגד פטריות על מנת למנוע זיהומי חיידקים ופטריות של שיתוף תרבות האמבה ו לטובת כפל הווירוס. גם אנחנו יישמנו starvatio חדשn בינוני לשמור V. vermiformis בתנאים אופטימליים עבור וירוסים שיתוף תרבות. לבסוף, השתמשנו cytometry זרימה במקום תצפית מיקרוסקופית, וזה זמן רב, כדי לזהות את השפעת cytopathogenic. השגנו שני בידודים ממדגמים ביוב, להוכיח את היעילות של שיטה זו, ובכך להרחיב את אוסף Faustoviruses, כדי להבין טוב יותר את סביבתם, סגולי המארח תוכן גנטי.
גילוי וירוסים ענקים, במיוחד אלה השייכים לסדר Megavirales, שינה לחלוטין את עולם הווירוסים מבחינת גודל חלקיקים ואת המורכבות הגנום. הווירוסים היו בעבר חשבו להיות ישויות קטנות, ואת Mimivirus הופיע לשבור את כל הכללים. 1 נתוני metagenomic מצביעים על ההמצאות בכל המקום של וירוסים ענקים לא רק בסביבה, 2-5 אלא גם בבני אדם. 6 לכן, יש עדיין צורך לחפש וירוסים אלה בקנה מידה גדול. המגוון של וירוסים הענקים אלה הוערך באמצעות דגימה לא רק במגוון סביבות מימיות ומשקעים הקשורים בם ברחבי העולם, 7-11 אלא גם על ידי הקרנת מגוון של דגימות אנושיות 12,13 ו דגימות סביבתיות. 7,9 mimivirus polyphaga Acanthamoeba היה מבודד על-ידי שיתוף התרבות באמצעות הפרוטיסטים phagocytic, spp Acanthamoeba בעיקר. 14-16 אוסף שלם של וירוסים ענקים היה אז גםשבודד מארח לפרוטיסטים שצוין זה, מה שהפך את הקהילה המדעית להגביל הליך מחקר בידודה עבור spp Acanthamoeba. ברור הסתמכות זו על זן לארח אחת הביאה חלק גדול של וירוסים מתעלמים ממנה. עובדת הווירוס הענק, CroV, היה מבודד עם roenbergensis קפיטריה פרוטוזואה הימי הניע מאוד, 17,18 ממחיש את הצורך להשתמש במגוון רחב יותר של פרוטוזואה על מנת לגלות שושלות חדשות או משפחות של וירוסים ענקים. Reteno et al. הצליח לבחור פרוטוזואה אחר כמארחי תא אשר מעולם לא נעשה בה שימוש בעבר, ומבודד את שושלת אספר הקשורות החדשה של וירוסים ענקים (את Faustovirus בשם החדש). 19
בניסיון לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להרחיב את חברי שושלת ויראלי זה, שינינו נהלי הבידוד שלנו והשתמשנו בם כדי להקרין דגימות סביבתיות מסוגלות קצירת Faustoviruses החדש. לאחר מכן, אנותאר את הפרוטוקול כולו לאפיין את הבידודים החדשים. החוקרים העריכו vermiformis Vermamoeba, את לפרוטיסטים חסרת חיים השכיח ביותר בקרב בסביבות האדם, 20-22 שכבר משמש את בידודה של אבטיפוס Faustovirus הראשון E12. 19 זה לפרוטיסטים כרגע עדיין לארח ספציפי עבור Faustovirus. ידענו שאף אחד הווירוסים הענקים הידועים היה פתוגניים עבור אמבה זה, כי אף ניסיונות לגדל וירוסים ענקים אחרים במעבדה שלנו הראתה תמוגה אמבה או צמיחת ויראלי. מסיבה זו, אנו מאמינים כי V. vermiformis היא התמיכה הסלולרית הטובה ביותר והייחודית ביותר הידועים לבודד Faustoviruses חדש.
האפשרות Faustovirus יכול להיות החבר הראשון של משפחה חדשה Megavirales קרוב ASFV הוצע לראשונה על ידי Reteno et al., 19 אבל כמה הבדלים עדיין ניתן להבחין. נראה ברור אם Faustovirus צריך להצטרף למשפחת Asfarviridae או שמא במקום ליצור משפחה ויראלי המשוערת חדש. בעיה זו תדרוש חקירה נוספת, בפרט אפיו?…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements to make.
LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
Plates | Cellstar | France | 655180 |
PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |