신생아 쥐의 심근 경색, 심장 재생의 모델
Summary
This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.
Abstract
관상 동맥 결찰에 의해 유도 된 심근 경색 심장 수선과 재생의 기전을 연구하고 치료제에 대한 새로운 타겟을 정의하는 수단으로 여러 동물 모델에서 이용되고있다. 수십 년 동안, 전체 심장 재생의 모델은 양서류와 물고기에 존재하지만, 포유 동물 상대는 사용할 수 없습니다. 마우스는 재생 기능을 가지고있는 동안 윈도우 생후 최근 발견은 심장 재생의 포유 동물 모델의 확립하게되었다. 신생아 마우스에서 포유류의 심장 재생의 수술 모델이 여기에 표시됩니다. 간단히, 출생 후 하루 1 (P1) 마우스는 이소 플루 란으로 마취 및 저체온증을 유도하는 얼음 패드에 배치됩니다. 흉부가 개방되어, 관상 동맥 (LAD)를 좌전 하행이 가시화되면, 봉합은 좌심실의 심근 허혈을 가하기 위해 LAD 주위에 배치된다. 수술은 10 ~ 15 분 소요됩니다. 관상 동맥된다 시각화정확한 봉합 배치 및 재현성이 매우 중요. 심근 경색 및 심장 기능 부전은 각각 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색 및 심장 초음파에 의해 확인된다. 전체 재생 이십일일 후 심근 경색은 조직 학적으로 확인됩니다. 이 프로토콜은 심근 경색 후 포유류 심장 재생 메커니즘을 규명하는 도구로 이용 될 수있다.
Introduction
심근 경색 (MI)는 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며, 심부전 케이스 (1)의 약 1/3을 담당 남아있다. 경피적 중재 및 혈전 용해제의 사용의 지속적인 최적화의 출현은 MI, 심근 사망과 심근 수축성 손실 다음 재관류 증가되었지만, 그럼에도 불구하고 일어난다. 또한 후보자하지 않거나이 개입에서 혜택을 볼 수 없습니다 "노 옵션"환자의 다수가 남아있다. 이 환자들은 경색 치료의 메커니즘으로 형성과 해로운 심실 리모델링 흉터로 이어지는 사용하지 허혈가 계속 발생. 이러한 과정은 결국 예후가 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 및 베타 차단제와 최적의 약물에도 불구하고 여전히 좋지 관리되는 심부전을 초래한다. 불행하게도, 심각하게 손상 좌심실 기능을 가진 환자의 1 년 사망률은 여전히 남아있다26 %이 높은. 심장 이식은 심부전 환자의 최종 치료 옵션입니다. 그러나, 심장 이식에 대한 제한 기증자 풀이 대부분의 환자에 대한 실행 가능한 옵션하지 않습니다. 따라서, 심근 손상을 복구하는 신규 치료제의 발견은 심장 질환의 문제를 해결하는 가장 중요한 남아있다. 심장 손상의 신뢰할 수있는 동물 모델 따라서이 과정의 중요한 구성 요소로 필요합니다.
전통적인 교리는 성인 심근 세포가 분할 또는 손상된 심근 3를 대체하는 탈 분화 능력이 후 유사 분열, 말기 차별화 된 세포 것을 지시했다. 따라서, 성인 포유류의 심장은 완전히 부상에서 회복하지 수, 손실 심근는 섬유 조직으로 대체 될 것이다. 따라서, 연구가 경색 팽창을 최소화하고 흉터 형성을 감소시키기 위해 주로 치료제에 집중하고있다. 보다 최근에는 다소 패러다임 변화가 발생한심장 치유와 많은 연구 노력을 둘러싸는 생각에 심장 재생 4의 가능성에 초점을 리디렉션되었습니다.
최근까지, 심장 중생의 생체 내 연구는 이러한 urodele 양서류 및 경골 어류 5-7에서와 비 척추 동물 모델에 제한되었다. 그러나, 신생 마우스의 심장 재생을위한 능력의 발견은 포유류 심장 수술 재생 두 모델의 개발을 주도하고있다 : 정점 심장 관상 동맥 폐쇄의 절제 심근 경색 8,9 유도. 2011 년, 마우스 정점 절제 모델은 전체 심장 재생이 출생 후 하루 1 (P1)에서 가능하다 보여주기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한 용량은 빠르게 초기 신생아 기 이후 감소. 포유 동물의 심장이 곧 전구 세포 수의 감소로 P7에서 출생 후 자사의 회생 가능성을 상실하고, 이핵 될 심근 잃을그들의 증식 능력, 영구적는 세포주기 10, 11을 종료합니다. 신생아 및 성인 포유류의 심장 사이의 근본적인 차이를 이해하는 것은 심장 재생에 대한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다.
정점 절제술이 실제로 수축 조직의 재 성장에 대한 통찰력을 제공하지만,이 모델은 치료제의 개발뿐만 아니라 적합하지 않습니다 따라서 일반적인 인간의 심장 부상을 시뮬레이션하지 않습니다. 관상 동맥 폐쇄 모델은, 그러나, 더 직접적으로 인간의 사용을위한 치료 발전에 적용 할 수있다 메커니즘에 더 유용한 통찰력을 제공 할 수있다, 따라서 MI 병리의 병태 생리 학적 측면을 시뮬레이션합니다.
사지 동맥 결찰 많은 동물 모델에서 12-14 유용한 실험적 기술로서 사용되어왔다. 성인 관상 동맥 결찰 모델에서, 동물을 마취 respirati 유지하면서 흉강의 개방을 허용하도록되어 삽관에. 심장은 관상 혈관의 시각화를 허용하고 정확한 봉합 배치를 허용, 정기적으로 이길하고 있습니다. 또한 관류가 계속 심장 분홍색을 유지하고 결찰 후 허혈성 심근 성공적인 관상 동맥 결찰을 나타내는, 창백한 나타납니다. 관상 동맥이 가시화되지 않고 외과 봉합사 (15)를 배치하는 위치를 추정해야하므로 신생아 쥐에 대해 기재된 프로토콜은 그러나, 덜 신뢰할 수있다. 관상 혈관의 일반적인 해부학 방향에있어서 동일한 개별 동물 가변성이며 LAD의 분기 (16)이 존재하더라도. "블라인드 것"때 따라서, 동맥 쉽게 놓칠 수 있습니다. 심장 초음파 등과 같은 다른 기술이어서, MI의 성공적인 도입을 확인하고, 모든 수술 유사한 경색 크기 될 수 있도록 요구된다. 개선은 LAD의 위치가 맛 음료 할 수있는 최근에 출판 된 방법 (15), 여기에 있습니다 설명졌으 따라서 LAD가 재현 MI를 유도하기 위해 결찰 할 수있다.
이 기술은 폐 붕괴가 발생하지 않는 신생아 마우스의 저체온 상태에서 개흉술과 같은 기관 내 삽관 또는 기계 환기를 필요로하지 않습니다. 그러나, 전술 한 방법에서, 심한 저체온증 완전한 무호흡 및 심장 리듬 (15)의 중단 두 지점으로 유도한다. 이 방법의 중요한 한계는 관상 동맥 관류 더이상 것이없고 심장도 LAD 결찰 전 담색 나타난다. 여기에 기술 된 방법에서는 관상 동맥의 시각화는 수술 후 신생아 마우스의 전체 복구 깊은 체온과 심장 박동 정지, 이전에 무기력의 지점에서 가능하다. 이 방법은 100 % 재현성의 중요한 이점을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 보여 수술 LAD 결찰 신생아 쥐에서 MI를 생산하는 신뢰할 수있는 방법이다. 이 모델은 포유류의 심장 재생을 연구하는있는 재현 모델과 연구자를 제공합니다. 관상 혈관의 시각화는 정확한 봉합 배치를 보장하고, 따라서 재현성을 보장하는이 방법의 핵심 구성 요소입니다. 성인 쥐 poikilothermic 기능을 갖고 있지 않지만, 체온 신생아 마우스 대사율 밀접 주위 온도와 관련된다. 또한, 신생아 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Q.F. (grant #MOP-119600).
Materials
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice |
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