אוטם שריר לב עכברים ילודים, מודל התחדשות לב
Summary
This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.
Abstract
אוטם שריר לב הנגרמת על ידי קשירת עורקים כלילית נעשה שימוש במודלים של בעלי חיים רבים ככלי ללמוד את המכניזם של תיקון לב והתחדשות, ולהגדיר מטרות חדשות עבור רפוי. במשך עשרות שנים, מודלים של התחדשות לב מלאה קיימים דו-חיים ודגים, אבל עמיתו יונק לא היה זמין. התגלית האחרונה של חלון לאחר לידה שבמהלכה עכברים בעלי יכולות משובים הובילה להקמת מודל יונק של התחדשות לב. מודל כירורגית של התחדשות לב יונקת העכבר בילוד מוצג במסמך זה. בקצרה, היום לאחר לידה 1 (P1) בעכברים מורדמים על ידי isoflurane והניחו על כרית קרח כדי לגרום היפותרמיה. לאחר החזה נפתח, ואת השמאלי הקדמי היורד לב כלילי (LAD) הוא מדמיין, תפר ממוקם סביב LAD לגרום איסכמיה לבבית בחדר השמאלי. ההליך הכירורגי לוקח 10-15 דקות. לדמיין את העורקים הכליליים הואחיוני עבור מיקום ואת שחזור תפר מדויק. אוטם שריר הלב וחוסר תפקוד הלב יאושרו על ידי כלוריד triphenyl-tetrazolium (TTC) מכתים אקוקרדיוגרפיה, בהתאמה. התחדשות מלאה 21 ימים לאחר אוטם שריר לב מאומת על ידי היסטולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ככלי להבהיר מנגנונים של התחדשות לב יונקת לאחר אוטם שריר לב.
Introduction
אוטם שריר הלב (MI) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, ונשאר אחראי כשליש מהמקרים אי ספיקת לב 1. בעוד כניסתו של התערבות מלעורית ואופטימיזציה מתמדת של שימוש thrombolytics גדלה reperfusion הבא MI, מות cardiomyocyte ואובדן שריר לב התכווצות בכל זאת מתרחשת. יש גם להישאר מספר רב של "אין-אפשרות" לחולים שאינם מועמדים או לא רואים תועלת התערבויות אלה. חולים אלה ממשיכים לחוות איסכמיה השבתת מוביל צלקת היווצרות שיפוץ חדרית מזיק כמנגנון של ריפוי אוטם. תהליך זה בסופו של דבר התוצאות אי ספיקת לב, אשר הפרוגנוזה נשאר עני למרות ניהול תרופתי אופטימלי עם מעכבי אנגיוטנסין-המרת אנזים (ACE) וחוסמי בטא. למרבה הצער, שיעור התמותה לשנה עבור חולים עם תפקוד חדר שמאל נפגע קשה עדיין נשארגבוה ככל 26% 2. השתלת לב היא אופציית הטיפול הסופי עבור חולים עם כשל לבבי. עם זאת, את מאגר התורמים המוגבל השתלת לב לא להפוך את זה אפשרות מעשית עבור רוב החולים. לפיכך, חשיפת סוכנים טיפוליים חדשניים כדי לשחזר את שריר לב הניזוק נשארת עליונה לפתרון הבעיה מהחלות-הלב. במודלים של בעלי חיים אמינים של פגיעה לבבית ולכן נדרשים כמרכיב קריטי של תהליך זה.
דוגמא מסורתית כתיב כי cardiomyocytes המבוגר הם-mitotic פוסט, תאים מובחנים סופנים, מסוגל חלוקתם או דה-הבחנה להחליף את שריר הלב הפגוע 3. ככזה, לב יונקי בוגרים לא יכול להחלים לגמרי מפציעה, ו cardiomyocytes אבד יוחלף עם רקמה סיבית. לפיכך, מחקר התמקד בעיקר בתרופות כדי למזער התרחבות אוטמת ולהפחית היווצרות צלקת. לאחרונה עם זאת, שינוי פרדיגמה התרחשבחשיבה סביב ריפוי לב מאמצי מחקר רבים כבר מנותב להתמקד פוטנציאל התחדשות לב 4.
עד לאחרונה, in vivo המחקר של התחדשות לב הוגבל דגמים שאינם חוליות, כגון אלה דו חיים urodele ו teleost דגים 5-7. אולם גילוי יכולת התחדשות לב של העכבר בילוד הוביל להתפתחות של שני מודלים כירורגית של התחדשות לב יונקת: כריתה של הספיגה העורק איפקס הכליליים של הלב לגרום לאוטם שריר לב 8,9. בשנת 2011, מודל כריתת איפקס עכבר שמש על מנת להוכיח כי התחדשות לב מלאה אפשרית יום לאחר לידת 1 (P1). אולם, קיבולת זו צונחת בתוך זמן קצר לאחר תקופת בילוד הראשונית. הלב היונק מאבד פוטנציאל ההתחדשות שלה זמן קצר לאחר לידה ב P7 כמו ירידה במספרי תא אב, ואת cardiomyocytes הופך binucleated, לאבדכשירות השגשוג שלהם, ולצמיתות לצאת 10,11 מחזור התא. הבנת ההבדלים הבסיסיים בין בילוד ולב יונק בוגרים עשויה להוביל לתובנה רומן לתוך התחדשות לב.
בעוד כריתת איפקס אכן מציעה תובנה מחדש הצמיחה של רקמת התכווצות, המודל אינו לדמות פציעת לב אנושית טיפוסית, ולכן אינו להשאיל עוצמה כמו גם אל בפיתוח התרופה. המודל חסימה של העורקים הכליליים, אולם, באופן ישיר יותר המדמה את ההיבטים pathophysiologic של פתולוגיה MI, ובכך עשויה לספק תובנות מועילות יותר לתוך המנגנונים שעשויים לחול על קידום טיפולי לשימוש בבני אדם.
קשירת כלילית כירורגי נעשה שימוש כטכניקה ניסיוני שימושי במודלים של חיות רבות 12-14. בשנת מודל הקשירה כלילית עורק המבוגרים, בעלי חיים מורדמים חובר לצינור לאפשר פתיחת בית החזה תוך שמירת respiratiעַל. הלב ממשיך לפעום באופן סדיר, המתיר ההדמיה של כלי הדם הכליליים ומאפשר עבור מיקום תפר מדויק. יתר על כן, הלב נשאר ורוד כמו זלוף ממשיך, ואחרי קשירת שריר לב איסכמי מופיע חיוור, המציין קשירת עורקים כלילית מוצלחת. הפרוטוקול המתואר לעכברים ילודים, אולם הוא פחות אמין כמו העורקים כליליים לא דמיינו והמנתח חייב להעריך היכן למקם את התפר 15. למרות האנטומיה כללית של כלי הדם הכליליים זהה, השתנות חיה הפרט בכיוון הסתעפות של LAD קיים 16. לפיכך, כאשר "הולך עיוור," העורק יכול בקלות לפספס. טכניקות אחרות כגון אקו הם מכן נדרשו לאשר אינדוקציה מוצלחת של MI, ועל מנת להבטיח את כל הניתוחים לגרום גודל אוטם דומה. המתואר כאן הוא שיפור על שיטה שפורסמו לאחרונה 15, שם עמדת LAD ניתן established ובכך LAD ניתן ligated לגרום MI reproducibly.
טכניקה זו אינה דורשת אינטובציה endotracheal או אוורור מכני, כמו פתיחת בית החזה במצב היפותרמיה בתוך העכבר הילוד לא לגרום לקריסת הריאות. עם זאת, בשיטה שתוארה לעיל, היפותרמיה חמורה חייבת להיגרם עד לנקודה של שני להשלים דום נשימה והפסקה של קצב לב 15. המגבלה העיקרית של גישה זו היא כי העורק הכלילי הוא perfused כבר לא והלב מופיע חיוור עוד לפני קשירת LAD. לפי הגישה המתוארת כאן, ויזואליזציה עורק כלילי אפשרי בנקודה של קהות חושים לפני היפותרמיה עמוק והפסקת קצב לב, עם החלמה מלאה של העכבר בילוד לאחר הניתוח. שיטה זו מציעה יתרון גדול של שחזור 100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
קשירת LAD כירורגית הפגינו בזאת היא שיטה אמינה לייצר MI בעכברים הילוד. מודל זה מספק חוקרים עם מודל לשחזור שבה ללמוד התחדשות לב יונקת. ויזואליזציה של כלי הדם הכליליים היא מרכיב מרכזי של שיטה זו, הבטחת מיקום תפר נכון ובכך להבטיח שחזור. בעוד עכברים בוגרים אינם בעלי יכולות poik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Q.F. (grant #MOP-119600).
Materials
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics–2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- . Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D’Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
