RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em> Listeria monocytogenes</em> Makrofaj
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Hücre içi bakteriyel patojenler ─ bulaşıcı hastalıklar ve büyüyen insan konak iç hücrelerini üretebilen neden olan bakteriler ─ dünya çapında önemli bir sağlık sorunu 5 vardır. istila ve bir memeli hücre içinde çoğaltmak için, hücre içi patojenler sofistike virülans mekanizmaları ve faktörleri edindik. bu mekanizmalar bir hastalığa neden yeteneği temel olmakla birlikte, biz onların düzenlenmesi ve dinamikleri hakkında çok az şey biliyoruz. sıvı ortamda yetişen bakteri geni ekspresyonunun konak hücreleri içinde, gerçek bir ortam yansıtamıyacağından, hücre içi niş yetiştirilen bakteri analiz transcriptome için giderek artan bir ihtiyaç vardır. Bu tür analizler ev sahibi tarafından tetiklenen spesifik bakteriyel uyarlamalar deşifre sağlayacak ve tedavi tasarımı için yeni hedefler belirlemeye yardımcı olacaktır. memeli RNA da bakteriyel RNA sayıca üstün beri hücre yetiştirilen bakterilerin Transcriptome analizi son derece zorluen az on kat. Bu yazıda, fare makrofaj hücreleri içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerden bakteriyel RNA izole etmek için deneysel bir yöntem açıklanmaktadır. ekstre RNA, hücre içi uyarlama ve RT-PCR, RNA-DİZ, mikrodizi ve diğer melezleştirme tabanlı teknolojiler gibi transkripsiyon analizleri çeşitli tekniklerle, patojenik bakterilerin hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
L. monocytogenes insanlarda listeriosis etkeni öncelikle immün sistemi baskılanmış bireyler, yaşlılar ve hamile kadınlar 6 hedefleyen klinik bulgularla seyreden bir hastalıktır. O 7 çalışma evsahibi-patojen etkileşimlerinin bir model olarak yıllardır kullanılmaktadır memeli hücrelerinin geniş bir dizi işgal bir Gram-pozitif fakültatif hücre içi patojendir. istila etmesine, bu t kaçmasına gereken bir vakuol ya da (fagositik hücreler durumunda), bir fagozomun, başlangıçta bulunduğuo çoğaltmak için hücre sitoplazmada ev sahipliği. Muhtelif virülans faktörlerinin çıkış işlemi, temel olarak, gözenek-oluşturucu hemolisin, listeriolisin O (LLO) ve iki ek fosfolipazları 8 aracılık ettiği gösterilmiştir. Sitoplazmada bakteriler (Şekil 1) hücre içindeki aktin filamentler kendilerini itmek için ve hücreden hücreye yayılan konak aktin polimerizasyonu makineleri kullanıyoruz. L. Bütün büyük virulans faktörleri işgali, hücre içi yaşam ve çoğaltmaya katılan monocytogenes, ana virülans transkripsiyon regülatör PrfA. 8-10 aktive edilir.
Son on yılda, çeşitli çalışmalar bize tarafından yürütülen ve diğerleri başarıyla konakçı hücrelere 2,11-15 içinde hücre yetiştirilen bakterilerin transcriptome analizi için yöntemler uyguladınız. sorumluluk yönün bakteriyel RNA 1) seçici zenginleştirme ve 2) RNA izolasyonu: İki temel yaklaşım dayanmaktadır konak-RNA bakteriyel RNA ayırmak için kullanılırrential hücre parçalama. Birinci yaklaşım (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, örneğin), memeli RNA moleküllerinin toplam RNA özleri eksiltici hibridizasyon ve bakteriyel transkribe dizileri (SCOTS) 11 seçmeli tutma dayanır. İkinci yaklaşım, bakteriyel hücreler gibi kalır, ev sahibi hücrelerin lize olan bakteri ve konakçı hücreler, ayırıcı liziz dayanır. Bakteriyel hücreler daha sonra, genellikle santrifüjleme ile konakçı hücre lizatından ayrılır ve RNA, standart teknikler kullanılarak ekstre edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ana problem, sağlam bakteri konakçı hücreler çekirdekleri de izole ile birlikte, bu şekilde RNA preparatları de memeli RNA içeren bir. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir yolu, bu prosedür genellikle çıkarma sırasında gen tanımlama profili değişikliklerin endişesini zaman alır ancak diferansiyel santrifüj kullanılarak konakçı hücreler çekirdeklerden sağlam bakteri ayırmaktır. Bu yazıda gelişmiş ve hızlı ba sunmakHücre diferansiyel parçalama yaklaşıma dayanmaktadır cteria RNA ekstraksiyon protokolü. İlk olarak, L. makrofaj hücreleri enfekte monocytogenes soğuk su ile lize edilmiştir. Daha sonra, makrofaj çekirdekler kısa bir santrifüjleme ile ayrılmış ve sağlam bakteri hızlı, RNA bakteriyel nükleik asitlerin sıcak fenol-SDS ekstraksiyonu kullanılarak izole edilir, filtre üzerinde toplanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol L. bakteriyel RNA izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntemle temsil makrofaj hücrelerinde hücre büyüyen bakterilerin monocytogenes. Bu protokol, hücre ayırıcı liziz göre ve bakteriyel RNA zenginleştirilmesi için iki ana adımları içerir: santrifüj ve süzme ile bakterilerin hızlı bir koleksiyonunu kullanarak makrofaj çekirdekler çöktürülür. Bu adımlar, standart RNA ekstraksiyon prosedürü izlemektedir. Bu protokol, Lısterıal RNA saflaştırma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3’Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
