Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Исследование экзосома в течение последних трех лет значительно расширили сферу в сторону идентификации и характеристики биомаркеров и их терапевтического применения.
Экзосомы недавно было показано, содержат микроРНК (Мирс). Миры сами по себе возникли как ценные биомаркеров для диагностических целей. Как сбор проб в клиниках и больницах довольно изменчиво, микроРНК изоляция от всей желчи существенно различается. Для достижения надежных, точных и воспроизводимых профилей микроРНК из собранных образцов желчи простым способом потребовало разработки протокола высокого качества, чтобы выделить и охарактеризовать экзосомы от желчи. Метод требует несколько центрифугировани и стадию фильтрации с конечной стадией ультрацентрифугирования, чтобы осадить обособленные экзосомы. Электронная микроскопия, Вестерн-блоты, проточной цитометрии и многопараметрического наночастицами оптический анализ, если таковые имеются, являются важнейшими этапами определения характеристик для проверки качества еxosomes. Для выделения микроРНК из этих экзосомы, спайковой лизата с неспецифическим, синтетический микроРНК из вида , как Caenorhabditis Элеганс, т.е. Cel-микроРНК-39, имеет важное значение для нормализации эффективности экстракции РНК. Выделение экзосома из желчной жидкости следуя этому методу позволяет успешно микроРНК профилирование из образцов желчи, хранившихся в течение нескольких лет при температуре -80 ° С.
Как и в других биологических жидкостях, то есть грудное молоко, плазме крови или моче, желчи содержит экзосомы, богатой липидами везикулы 1-4. Экзосомы могут вызывать или изменять биологические функции в клетки – реципиенты 5, 6, форма межклеточной связи , которая может быть частью их нормальной функции 4, 7-9. Экзосомы может содержать видов микроРНК , которые могут обеспечить ценный источник биомаркеров для диагностики 10. профили микроРНК получили значительное внимание в последние годы в качестве диагностических и прогностических маркеров различных заболеваний 11-14 лет.
Сам микроРНК можно найти в биологических жидкостях, возможно, высвобождаемых мертвых клеток и количество пролитой клеток может в значительной мере зависеть от основного заболевания. Профиль микроРНК экзосом не обязательно отражает профиль микроРНК от инициирующего элемента 6, 10, 15-17, но экзосомы может нести подписи микроРНК , которые могут быть характерны для родителей CEбудете как клетка опухоли. Опухолевые полученных экзосомы были идентифицированы в плазме пациентов с аденокарциномой легкого, рака предстательной железы и других опухолей 8, 16, 18.
Целью данного метода является надежным и надежная изоляция экзосомы из образцов желчи человека, в значительной степени зависит от их предыдущих процедур обработки. Она была разработана , чтобы использовать желчь в качестве надежного источника микроРНК для потенциальной диагностики заболеваний желчных протоков , таких как холангиокарциномой 19. Она состоит из нескольких этапов центрифугирования при увеличении скорости, чтобы изолировать экзосомы и могут быть применимы и к другим биологическим жидкостям.
Для того, чтобы надежно использовать экзосомы, выделенные из желчи, важно использовать последовательные методы высокого качества изоляции, чтобы получить высокие образцы качества взамен. Методика определена в данной работе является устоявшейся способ изолировать экзосомы и микроРН?…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
LM10-HS | Nanosight | ||
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |