Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
la recherche de Exosome au cours des trois dernières années, a considérablement étendu le champ vers l'identification et la caractérisation de biomarqueurs et de leurs utilisations thérapeutiques.
Il a été démontré récemment exosomes pour contenir microARN (MIRS). Mirs se sont apparus comme biomarqueurs de valeur à des fins de diagnostic. Comme le prélèvement d'échantillons dans les cliniques et les hôpitaux est très variable, miRNA l'isolement de la bile toute varie considérablement. Pour obtenir des profils de miARN robustes, précis et reproductibles à partir d'échantillons de bile recueillies d'une manière simple nécessité l'élaboration d'un protocole de haute qualité pour isoler et caractériser les exosomes de la bile. Le procédé nécessite plusieurs centrifugations et une étape de filtration par une étape finale d'ultracentrifugation pour sédimenter les exosomes isolés. La microscopie électronique, Western blots, cytométrie en flux et l'analyse optique nanoparticule multi-paramètres, le cas échéant, sont des étapes cruciales de caractérisation pour valider la qualité de l'exosomes. Pour l'isolement des miARN de ces exosomes, Smasher le lysat avec un miARN synthétique non spécifique d'une espèce comme Caenorhabditis elegans, à savoir, Cel-miR-39, est important pour la normalisation de l' efficacité d'extraction d'ARN. L'isolement des exosomes à partir du liquide biliaire suivant cette méthode permet au succès miRNA profilage à partir d'échantillons de bile stockées pendant plusieurs années à -80 ° C.
Comme d' autres fluides biologiques, à savoir, le lait maternel, le plasma ou l' urine, la bile contient exosomes, lipides riches vésicules 1-4. Les exosomes peuvent induire ou altérer les fonctions biologiques dans les cellules réceptrices 5, 6, une forme de communication entre les cellules qui pourraient faire partie de leur fonction normale 4, 7-9. Les exosomes peuvent contenir des espèces miRNA qui peuvent fournir une source précieuse de biomarqueurs pour le diagnostic 10. les profils miARN ont gagné une attention considérable ces dernières années en tant que marqueurs diagnostiques et pronostiques pour une variété de maladies 11-14.
miRNA lui-même peut être trouvé dans les fluides biologiques, peut-être libéré par les cellules mortes et la quantité de cellules de hangar peut être fortement influencée par une maladie sous-jacente. Le profil miRNA des exosomes ne reflète pas nécessairement le profil miRNA de la cellule d'origine 6, 10, 15-17, mais exosomes peut porter des signatures miRNA qui pourraient être caractéristique de la CE parentalell aime une cellule tumorale. Exosomes dérivés de tumeur ont été identifiés dans le plasma de patients atteints d' un adénocarcinome du poumon, le cancer de la prostate et d' autres tumeurs 8, 16, 18.
Le but de cette méthode est l'isolement fiable et robuste des exosomes à partir d'échantillons de bile humaine, largement indépendantes de leurs procédures de traitement antérieur. Il a été développé pour utiliser la bile en tant que source fiable d'ARNmi pour le diagnostic potentiel des maladies du canal biliaire , tels que 19 cholangiocarcinome. Il se compose de plusieurs étapes de centrifugation, à des vitesses croissantes afin d'isoler les exosomes et pourrait être appliquée à d'autres fluides biologiques.
Pour utiliser de manière fiable exosomes isolés de la bile, il est important d'utiliser des méthodes d'isolement de haute qualité compatibles pour obtenir des échantillons de haute qualité en retour. La méthodologie définie dans le présent document est un moyen bien établi pour isoler les exosomes et microARN de la bile humaine. Il met en évidence plusieurs étapes cruciales dans la caractérisation des exosomes isolés qui, à un minimum devrait comprendre la microscopie électronique ou optique de n…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
LM10-HS | Nanosight | ||
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |