We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Hier hebben we een gedetailleerde procedure te beschrijven om efficiënt en rechtstreeks te leveren Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. We tonen de procedure voor het bereiden van H. influenzae entstof, intratracheale indruppeling van H. influenzae in de longen, het verzamelen van broncho-alveolaire lavage vloeistof (BALF), analyse van immuuncellen in de BALF en RNA-isolatie van differentiële genexpressie analyse. Deze procedure kan worden gebruikt om de long ontstekingsreactie op bacteriën, virussen of fungi. Direct tracheale instillatie wordt meestal de voorkeur boven intranasale of aërosol inhalatie procedures omdat het efficiënter levert het bacteriële inoculum in de onderste luchtwegen minder dubbelzinnigheid.
Ontsteking is een fundamenteel immuun mechanisme van verdediging tegen infectieuze agentia. Het bevordert pathogeen uitroeiing en de reparatie van beschadigd weefsel. Het vergemakkelijkt ook het herstel naar een normale gezonde toestand 1. Echter, ontregelde ontsteking leidt vaak tot chronische ontstekingsziekten 2. Luchtwegontsteking een initiële trigger voor verschillende longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en longfibrose 3.
De niet-typeerbare (ingekapseld) Haemophilus influenzae (NTHi) is geassocieerd met chronische bovenste en onderste long ontstekingsziekten 4,5. Het is de dominante species geïsoleerd uit de lagere luchtwegen van kinderen en volwassenen met chronische obstructieve longziekte 4,6,7. De ontstekingsreactie na NTHi infectie wordt gekenmerkt door de verhoogde expressie van pro-inflammatoire cytokinen (zoals TNF en IL-1β) en wordt gemedieerd by mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) en nucleaire factor-kB (NF-KB) door middel van toll-like receptoren (TLRs) 8.
Muis zijn zeer nuttige hulpmiddelen voor het analyseren van de onderliggende pathologie van long- ontsteking vanwege de beschikbaarheid van verschillende gen-deficiënte lijnen. Verscheidene methoden zijn voor levende / verzwakte bacteriën en bacteriële producten, waaronder intranasale instillatie en aërosol inhalatie 9,10 inoculeren. Hier tonen we intra-tracheale instillatie. Hoewel minder frequent gebruikt, deze benadering is efficiënter en zeer reproduceerbare vanwege de directe levering van het entmateriaal tot de onderste luchtwegen.
Hierin wij een unieke en minimaal invasieve procedure beschrijft de longen van muizen te inoculeren met een bacteriële ziekteverwekker long. We tonen aan dat deze procedure kan worden gebruikt om de functie van verschillende genen bij muizen die deficiënt zijn in de genen van inflammatoire signaalroutes zijn bestuderen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de ontstekingsreacties op virale en fungale longinfecties bestuderen. De voordelen van deze werkwijze ten opzichte van andere werkwijzen zoals intranasale of a…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
Iml syringe | BD | REF 309602 | |
Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
Agarose | peqlab | 35-1020 | |
5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
BSA | HyClone | SH30574.03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
Formaldehyde | Polyscience | 4018 |