우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.
인간의 건강과 질병의 중요한 조절 등의 미생물 지역 사회의 역할에 대한 성장 감사가있다. 높은 처리량 시퀀싱 기술은 다양한 소스로부터의 16S rRNA 유전자 서열을 이용하여 세균 사회의 신속하고 효율적인 특성을 허용하고있다. 16S rRNA의 서열 분석에 용이하게 사용할 수있는 도구는 표준화 된 계산 흐름을 가지고 있지만, DNA 추출을위한 시료 처리 연구에 걸쳐 변화의 계속 소스 남아있다. 여기에서 우리는 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 또한 서열 라이브러리의 생성, 데이터 품질 제어 및 서열 분석을 포함한 16S rRNA 유전자 서열 하류 방법을 서술. 워크 플로 자 해부학 적 위치 및 호스트 다양한 종에서 수집 면봉 등 다양한 샘플 유형을 수용 할 수있다. 또한, DNA 및 RNA를 회수 분리하여 사용할 수있다전체 게놈 시퀀싱 또는 RNA-서열을 포함한 다른 응용 프로그램에 대한. 설명 된 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고, 군 유전체학 및 유전자 전사 정보 하류 분석을 수용한다.
인간의 낮은 생식 기관, 소화 시스템, 호흡기 및 피부 조직의 항상성을 유지하고 호스트 1의 건강을 지원하기위한 중요한 복잡한 세균 지역 사회의 식민지된다. 예를 들어, 특정 유산균은 질 볼트를 산성화 항균 이펙터 생산 및 로컬 호스트 면역 2-4 변조하여 병원균에 대한 황폐 한 환경을 만들 수 있습니다. 박테리아 마이크로 바이 옴의 중요성에 대한 증가하는 감사는 또한 많은 임상 상황에서 세균 지역 사회의 특성에 대한 관심이 증가하고있다. 여기에서는 성기 면봉의 마이크로 바이 세균의 조성을 결정하는 방법을 설명한다. 프로토콜은 용이하게 다른 해부학 적 위치 및 다른 숙주 종에서 수집 대변 샘플 면봉을 위해 변형 될 수있다.
인해 주어진 스터드 수집 및 저장할 수있는 샘플의 수의 고유 제한Y 참가자는,이 프로토콜은 적응 페놀 – 클로로포름 기반 비드 치는 방법 5,6를 사용하여 단일 면봉의 잠재적 DNA, RNA, 심지어 단백질을 추출하도록 설계되었습니다. 세제와 비드 구타 및 화학 중단과 세균 세포벽의 물리적 파괴의 조합은 추가 효소 분해 단계없이, 그람 양성 그람 음성 및 항산 균의 신속한 용해 할 수 있습니다. 고품질의 RNA를 얻으려면, 그것은 또는 4 ° 이하로 유지하고 마른 면봉을 사용하는 것이 좋습니다 (C) 즉시 수집 후 및 -80 ° C에서 실험실 (해당되는 경우)에 전송 및 저장 장기간 동안.
주어진 샘플 내의 박테리아 마이크로 바이을 결정하기 위해이 과정은 현재 종합적 세균 분류 할당 상대적 정량을 수행 할 수있는 가장 경제적 인 방법이다 16S rRNA의 유전자의 증폭 순서화를 이용한다. 다른 방법이 qPCR에 7을 대상 포함, 사용자 정의 microarrAYS 8 및 전체 게놈 시퀀싱 구. 16S rRNA 유전자 아홉 가변 영역을 포함하고, 마이크로 바이 질 연구를위한 시퀀스 최적의 V 영역에 대한 합의가 없다. 여기에서 우리는 Caporaso 등. 10 ~ 12에 의해 설계 파이프 라인에 515F / 806R 프라이머 세트를 사용하여 구축 할 수 있습니다. Caporaso 외.의 515F / 806R 프라이머 세트 인해 Illumina의 시퀀싱 플랫폼과 검증 된 바코드 프라이머 및 호환성 수천의 가용성 단일 염기 서열의 실행에 샘플 수백 다중화 할 수 있습니다. 인간 마이크로 바이 옴 프로젝트의 27F / 338R 프라이머 (13) 설정과는 달리, 515F / 806R은 효과적으로 Bifidobacteriaceae를 증폭하여 정확하게 Gardnerella vaginalis에, 일부 여성의 질 미생물 지역 사회의 중요한 구성원 캡처합니다. 대안 적으로, 338F / 806R 프라이머 쌍을 성공적 질 샘플 14 및 515F / 926R 프라이머 쌍을 가지고 RECE의 pyrosequencing 사용되었습니다ntly 차세대 시퀀싱 12 가능해진다.
마지막으로,이 프로토콜은 미생물 생태학 (QIIME) 소프트웨어 패키지 (15)에 정량적 통계를 사용하여 16S에게 앰플 리콘의 분석을 수행하기위한 기본 지침을 제공합니다. 여기에 설명 된 QIIME 명령의 성공적인 구현은 각각의 샘플에 대한 세균 분류학 존재비를 포함하는 테이블을 산출한다. QIIME 사이트에 상세히 기술되는 바와 같이 많은 추가적인 품질 관리 단계, 분류 학적 분류 방법 및 분석 단계, 분석에 혼입 될 수있다 (http://qiime.org/index.html). 분석은 애플 컴퓨터에서 수행 될 경우, MacQIIME 패키지 (16)는 QIIME와 그 종속의 쉬운 설치를 제공합니다. 16S rRNA의 유전자 서열 분석을위한 대체 소프트웨어 패키지 Mothur 17 UPARSE (18)를 포함한다.
여기서 우리는 인간의 질 면봉 내에서 식별 및 상대 세균의 존재비의 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 시료와 같은 의자와 같은 종류이나 다른 신체 부위의 면봉과 다양한 소스로부터 수집 된 샘플에 대해 적응 될 수있다. 페놀과 클로로포름의 완충 용액에서 비드 박동에 의한 핵산의 추출은 임상 연구를 통해 수집 된 귀중한 샘플로 작업 할 때 특히 중요하다 모두 DNA와 RNA의 분리 수 있습니다. RNA의 동시 컬렉션 RNA-서열을 통해 기능 세균, 호스트 및 바이러스 성 기부를 결정 할 수있는 기회를 제공한다 분리 된 세균의 DNA는 세균 분류학 식별 및 게놈 어셈블리에 대한 우수하다. 설명 된 프로토콜이 성공적으로 인간, 송곳니 포함한 샘플 유형의 넓은 범위에 배치 된 검증 원스텝 프라이머 세트, 환경 시료 (10)를 사용하여 </suP>. 바코드 프라이머 수천의 가용성은 시퀀싱 비용 샘플과 엄청난 비용 절감의 다중화 수 있습니다. 200 샘플을 다중화하는 경우 (모든 시약, 하나의 시퀀스를 실행하고, 프라이머하지만 장비 포함) 전체 비용은 샘플 당 약 $ 20입니다. 또한, 동일한 샘플 위치에서 여러 면봉는 전체 파이프 라인을 통해 독립적으로 처리되는 매우 높은 재현성이있다. 전반적으로, 프로토콜, 효율적인 유연하고 안정적이며 반복적 인 비용이다.
이 프로토콜의 핵산 추출 부는 페놀 및 클로로포름으로 작업 할 때 필요한 안전 조치 및 높은 처리량, 96- 웰 플레이트 형식으로 파이프 라인 자동화의 어려움에 의해 제한된다. 또한, 활발한 비드 매질은 약 6 킬로 조각에 기계 용해 가위에 대한 세균의 DNA를 사용; 긴 DNA 단편의 하류 어플리케이션 비드 비팅 (S)의 시간에 필요한 경우hould 단축 될 수있다. 이 프로토콜의 박테리아 식별 부분의 제한 16S rRNA 유전자 염기 서열에 의존하는 방법에 고유합니다. 16S rRNA의 염기 서열은 속 심지어 종 수준으로 세균 식별을위한 이상적이지만, 거의 변형 수준의 식별 정보를 제공하지 않습니다. 16S rRNA 유전자의 가변 영역 V4 대부분의 세균 종 (11) 사이에 견고한 판정을 제공하지만, 예컨대 31 Oligotyping 추가적인 계산 방법은 정확하게 이러한 락토 crispatus 같은 특정 종류를 식별하는데 사용될 필요가있다. 이 프로토콜은 이러한 목적으로 사용할 수있는 전체 게놈 DNA 및 RNA의 추출을 가능하게하지만 최종적으로, 특히 시료 내의 정확한 세균 작용 성능에 관한 정보는, 단독으로 16S rRNA 유전자 서열 분석에 의해 결정될 수 없다.
이 프로토콜 성공을 보장하는 가장 중요한 단계는 오염의 지속을 방지하기 위해 상당한주의를 취하고있다보내고 샘플 수집, 핵산 추출 및 PCR 증폭. 깨끗한 장갑을 착용하고 멸균 면봉, 튜브, 가위를 사용하여 시료 채취시 무균를 확인합니다. 수집 물질의 오염 평가하기 위해, 샘플링시에 반송 관에 직접 추가 미사용 면봉을 배치하여 음성 대조군 면봉을 모은다. 실험실에서, 단지 오염 제거 용품을 포함하는 단 분자 학년, DNA가없는 시약을 사용하여 멸균 후드에있는 모든 사전 증폭 단계를 수행합니다. 핵산 추출하는 동안, 사용하지 않는 폐쇄 모든 튜브를 각 샘플 새로운 멸균 집게와 신선한 장갑을 사용하고 유지하여 교차 오염을 방지합니다. 평행하지 않는 면봉을 처리하는 샘플 수집 및 핵산 추출 양의 무균을 보장한다; 사용되지 않는 면봉은 이소프로판올 침전과 에탄올 세척 후 펠렛을 양보해서는 안된다. 펠릿이 나타나지 않는 경우의 가능한 원인을 확인하기 위해 16S rRNA 유전자 증폭을 수행오염은 (예를 들어, 연쇄상 구균 또는 존재 피부 오염을 나타낼 것이다). 또한, PCR 반응 시약 및 오염되지 않은 것을 보장하기 위해 병렬 없음 템플릿 제어 반응으로 증폭 된 PCR를 수행한다. 밴드가 아니 템플릿 컨트롤에 표시되는 경우, 시약을 폐기하고 새로운 시약으로 증폭를 반복합니다. 이러한주의 사항을 복용 관심있는 박테리아의 성공적인 시퀀싱을 보장합니다.
상기 증폭 된 PCR 증폭 단계는 대부분의 문제를 요구하는 경향이있다. 열두 샘플 세트로 증폭하면 효율과 일관성 사이의 균형을 제공한다. 주어진 증폭 세트의 모든 샘플에서 밴드의 완전한 부재는 예를 들면, 시약을 추가 잊고 또는 잘못 열 순환기를 프로그래밍, 시스템 적 오류를 나타냅니다. 몇몇 샘플에서 밴드의 부재는 사람의 실수에 주로 기인하고 증폭 다시 R을해야샘플 및 역방향 프라이머의 동일한 쌍으로 해제. 밴드의 유무를 계속하는 경우, 시료가 다른 바코드와 역방향 프라이머를 사용하여 재 증폭 될 수있다. 여러 역방향 프라이머와 반복 증폭 실패는 시료에 존재하는 억제제를 나타낼 수 있습니다. 이 경우, 열으로 DNA를 청소 종종 상당히 상대 세균 존재비를 변경하지 않고 억제제를 제거합니다. 다중 대역이 증폭 후 발생할 경우, 다른 역방향 프라이머 바코드 샘플을 재-증폭.
라이브러리 풀을 제조 할 때 환경 오염을 방지하고, 하나의 특정 증폭 생성물을 보장 외에도 성공 시퀀싱 치료에 의존한다. 목표는 약 시퀀싱 동일한 수의 샘플 당 판독되도록 각 시료의 증폭 몰량을 결합하는 것이다. 종래 증폭 핵산 농도를 비교하는 경우, 단순히 각각 SA 같은 부피 첨가라이브러리 풀을 만들 때 mple의 증폭은 충분하다. 핵산 농도는 크게 상이하고, 동량으로 첨가하는 경우에는, 저 핵산 농도와 시료의 잘못 읽기 낮은 숫자로 표현한다. 이 경우에, 겔 밴드의 상대 강도에 기초하여 상기 저농도 샘플에서 증폭 높은 볼륨을 추가 할 수있다. 대안 적으로,보다 엄밀 샘플 몰량을, 각 앰플 리콘의 프라이머를 제거하려면 형광 dsDNA 정량 키트를 사용하여 각각의 시료의 앰플 리콘의 농도를 정량화하고 정확하게 조합 할 수있다.
균형 앰플 리콘 풀이 생성되면 신중 풀의 농도를 측정하는 것이 중요해진다. PhiX 후속주의 희석 스파이크의 판독의 복잡성이 최적의 시퀀싱 결과를 달성하는데 중요 증가. sequen를 사용하여 높은 처리량 시퀀서합성으로 향하도록는 플로우 셀의 클러스터의 농도에 매우 민감하다. 너무 낮은 품질 점수, 낮은 데이터 출력 및 부정확 한 역 다중화 (32), overclustering가 발생합니다 집중 라이브러리 풀로드. 너무 또한 낮은 데이터 출력됩니다 희석 된 라이브러리 풀로드. 조심스럽게 이전 순서로 라이브러리 풀을 정량화하는 것은 최적의 결과를 보장합니다.
16S rRNA 유전자 염기 서열은 주어진 샘플 내에 존재하는 박테리아의 포괄적 인 평가를 제공하고, 가설 생성에 절대적으로 중요한 첫 번째 단계입니다. 또한 메타 데이터의 풍부한의 존재는 특정 박테리아 종과 중요한 생물학적 요인 사이의 연결을 테스트 할 수있는 연구를 할 수 있습니다. 또한, 동일한 16S 정보는 PICRUSt 33 도구를 사용하여 세균 기능을 추론하는데 사용될 수있다. 궁극적 인 목표는 새로운 연결이 될 수 식별 할 수 16S 특성을 사용하는 것입니다추가 테스트 및 인간의 건강과 질병에 세균 마이크로 바이 옴의 영향을 우리의 성장 이해에 추가 모델 시스템에서 확인.
The authors have nothing to disclose.
우리는 프로토콜에 중요한 피드백 엘리자베스 바 이른, 데이비드 Gootenberg, 그리고 크리스티나 Gosmann 감사드립니다; 샘플 준비 안내 및 시위에 대한 메간 볼드리지, 스콧 HANDLEY, 신디 모나코, 제이슨 노먼; 프로토콜 조언과 유익한 토론 웬디 가렛, 커티스 Huttenhower, 건너 뛰기 버진, 브루스 워커; 시퀀싱 지원 제시카 Hoisington – 로페즈. 이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단과 NIAID (1R01AI111918)에 의해 지원되었다. DSK는 버로우즈 웰컴 펀드에서 추가 지원을 받았다. MNA 보너스 번호 NIGMS에서 T32GM007753, 그리고 바울과 데이지 소로스 원정대에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIGMS 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
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Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |