我们描述了从拭子用16S rRNA基因扩增子测序细菌群落特征提取核酸的高效,可靠和成本有效的方法。该方法允许对多种样品类型共同的处理方法,并容纳许多下游分析流程。
有微生物群落为人类健康与疾病的关键调制器的作用日益升值。高通量测序技术已经允许用于使用16S rRNA基因测序从各种来源的细菌群落的快速和有效的表征。虽然的16S rRNA序列分析现成的工具都有标准化的计算工作流程,提取DNA样本的处理仍然是变异的不同研究的持续来源。在这里,我们描述了从拭子中提取核酸的高效,可靠和成本有效的方法。我们也对划定的16S rRNA基因测序下游方法,包括新一代测序库,数据质量控制,及序列分析。工作流可以容纳多个样品类型,包括粪便和各种解剖位置和宿主物种的采集拭子。此外,回收的DNA和RNA可以分离并用于对于其它应用,包括全基因组测序或RNA-起。所描述的方法允许对多种样品类型共同的处理方法,可容纳的基因组,宏基因组和转录信息下游分析。
人类的下生殖道,胃肠系统,呼吸道和皮肤是由维持组织稳态和配套主机1的健康至关重要复杂的细菌群落定植。例如,某些乳酸菌通过酸化阴道穹窿,产生抗菌效应和调制本地宿主免疫2-4创建病原体荒凉环境。对于细菌微生物的重要性日益升值也增加了许多临床表征环境细菌群落的兴趣。在这里,我们描述了一种方法,以确定从生殖器拭子细菌微生物的组合物。该协议可以很容易地修改从其他解剖位置和其他的宿主动物的粪便样品和棉签。
由于能够收集和存储从给定螺栓中的样本数量的固有限制ý参与者,该协议的目的是用一个适于苯酚-氯仿基于珠子的打浆方法-5,6-提取DNA,RNA,甚至潜在蛋白由单一拭子。与珠打浆和化学破坏用清洁剂细菌细胞壁的物理破坏的组合允许在不附加酶消化步骤革兰氏阳性,革兰氏阴性和抗酸细菌的迅速溶解。获得高品质的RNA,它建议使用保持在或低于4°即干拭子Ç采集后立即并运送至实验室(如果适用的话),并且存储长期在-80℃中。
要确定一个给定的样本中细菌的微生物,该程序利用16S rRNA基因扩增子测序,这是目前最具成本效益的手段,全面分配细菌分类,并执行相对定量。替代方法包括定量PCR针对性7,自定义microarrAYS 8和全基因组测序9。 16S rRNA基因包含九个高变区,并且没有关于最佳V区测序阴道微生物的研究一致。这里我们使用515F / 806R引物,并建立对管道通过Caporaso 等 10-12设计。 Caporaso的等 515F / 806R引物组能够数百个样品在单个测序运行的多路复用由于十万验证条形码引物和与Illumina的测序平台的兼容性的可用性。不同于人类微生物组项目的27F / 338R引物对13,515F / 806R也有效地放大Bifidobacteriaceae,从而准确地捕捉阴道加德纳菌 ,一些女性阴道微生物群落的重要成员。或者,338F / 806R引物对已被成功地用于阴道样品14和515F / 926R引物对具有RECE的焦磷酸测序下一代测序12 ntly变得可用。
最后,该协议提供了基本的说明来使用定量洞察微生物生态学(QIIME)软件包15进行16S扩增分析。成功地实施此处描述的QIIME命令产生包含每个样品细菌分类学丰度的表。许多额外的质量控制步骤,分类学分类方法,以及分析步骤可以并入分析,作为QIIME网站上详细描述(http://qiime.org/index.html)。如果分析将在苹果电脑上执行,该MacQIIME包16提供了易于安装QIIME及其依赖的。为16S rRNA基因序列分析替代软件包包括Mothur 17和18 UPARSE。
在这里,我们描述了一个人的阴道拭子中的鉴定和相对丰度细菌表征的协议。该协议可以很容易地适用于其他类型的样品,如粪便和其他身体部位拭子,和用于从各种各样的源收集样品。核酸的通过珠打浆在苯酚和氯仿的缓冲溶液中提取允许DNA和RNA,以通过临床研究收集珍贵样品工作时,这是特别重要的隔离。分离的细菌DNA是极好的细菌分类鉴定基因组和组装,而RNA同时采集提供了机会,通过RNA-seq中确定细菌的功能,主机和病毒的贡献。所描述的协议使用验证的一步法引物组已成功地部署在广泛范围的样品类型,包括人,犬的,和环境样品10 </suP>。数以千计的条形码引物的可用性使测序成本的样品和巨大的储蓄复用。完全成本(包括所有的试剂,单个测序运行,和引物但不包括设备)约为20 $每个样品时,200个样品进行复用。此外,还有当从同一样品网站的多个拭子穿过整个管道独立处理的非常高的再现性。总体而言,该协议是成本高效,灵活,可靠和可重复的。
这个协议的核酸提取部分是通过用酚和氯仿工作时所需要的安全预防措施,和自动化的管道高通量,96孔板格式的挑战限制。此外,所用的蓬勃珠磨机械剪板机裂解细菌DNA约6千碱基片段;如果较长的DNA片段所必需的下游应用,珠击S的持续时间HOULD被缩短。这个协议的细菌鉴定部的局限性是固有的,它依赖于16S rRNA基因测序的任何方法。 16S rRNA基因测序是理想的细菌鉴定属,甚至种的水平,但很少提供应变水平鉴定。而16S rRNA基因的V4可变区提供之中大多数细菌物种11健壮歧视,附加的计算方法如Oligotyping 31可能需要用来精确识别某些物种,如卷曲乳杆菌 。最后,关于特定样品内的精确细菌功能能力信息无法通过16S rRNA基因测序单独虽然这个协议使全基因组DNA和RNA,可以实现这一目的可使用的萃取而测定。
为保证这一协议成功的最关键步骤是采取非常谨慎,以防止造成污染DURING样品收集,核酸提取和PCR扩增。戴上干净的手套,并用消毒棉签,管,剪刀确保样本采集的时间不育。为了评估集合材料的污染,通过直接放置附加的未使用的拭子插入输送管在采样时收集阴性对照拭子。在实验室中,执行只含有消毒用品和只使用分子级,无DNA试剂消毒罩所有预扩增步骤。在核酸提取,防止交叉污染,通过使用新的无菌镊子和新鲜的手套每个样本,并保持除非使用全封闭的管。在并行处理中未使用的棉签确保样品收集和核酸提取两个不育;未使用拭子不应该产生异丙醇沉淀和乙醇洗涤后的颗粒。如果粒料确实出现,则执行16S rRNA基因的扩增,以确定的可能来源的污染( 例如, 链球菌属或葡萄球菌的存在将指示皮肤污染)。另外,进行PCR扩增以并联无模板的对照反应,以确保PCR试剂和反应都没有被污染。如果一个乐队出现在一个无模板对照,弃试剂和用新鲜试剂重复放大。采取这些预防措施,将确保目标细菌的测序成功。
PCR扩增步骤往往需要最故障排除。在套十二样品扩增提供效率和一致性之间的平衡。完全没有在给定的放大集所有样品的乐队表示系统故障, 如忘记加试剂或不正确编程热循环。没有来自几个样品的频带通常是由于人为错误,并且扩增应重新-R未与样品和反向引物的相同的配对。在持续不存在的频带的情况下,可将样品使用的反向引物具有不同的条形码再扩增。具有多个反向引重复扩增失败可能表示存在于样品中的抑制剂。在这种情况下,清洗该DNA与一列将经常除去抑制剂,而不显著改变相对细菌丰度。如果放大后多频段造成的,重新放大具有不同的反向引物的条形码样本。
除了防止环境污染和保证单个特定产物的扩增,成功测序制备文库池时依赖于治疗。我们的目标是等摩尔量的每种样品的扩增子的结合,以确保每个样品大约相同数目的测序读操作。如果之前扩增核酸浓度具有可比性,简单地增加每个SA等体积创建库池时mple的扩增子就足够了。然而,如果核酸浓度有很大的不同,并且在等体积增加,与低核酸浓度的样品将很差具有低数目的读取表示。在这种情况下,有可能从基于凝胶带的相对强度的低浓度样品添加量较高的扩增子。可替代地,能够更严格地从各扩增子除去引物,使用荧光的dsDNA定量试剂盒量化个体样品的扩增子浓度,并精确地结合等摩尔量各样品。
一旦生成一个均衡的扩增子池,它成为至关重要的仔细测量池的浓度。随后小心稀释和穗与PhiX增加了复杂性阅读是实现最佳的测序结果的关键。使用sequen高通量测序仪通过合成CING是在流动池的群密度非常敏感。加载一个过于集中将导致overclustering,质量得分较低,较低的数据输出,和不准确的解复用32的库池。加载库池太稀也会导致低的数据输出。仔细量化库池测序之前将保证最佳的效果。
16S rRNA基因测序提供了一个给定的样本中存在的细菌进行了全面评估,并在产生假设一个绝对关键的第一步。一组丰富的元数据进一步的存在使得研究者来测试特定细菌种类和重要的生物因子之间的关联。此外,相同的16S信息可以用来推断与工具如PICRUSt 33使用细菌的功能。最终的目标是使用16S表征,以确定新的关联性,可以是进一步的测试和模型系统验证,加入到我们的细菌微生物对人类健康和疾病的影响,越来越多的了解。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢伊丽莎白·伯恩,大卫Gootenberg,和克里斯蒂娜Gosmann有关该协议的关键反馈;梅根·鲍德里奇,斯科特·汉德利,辛迪摩纳哥,和Jason诺曼样品制备指导和示范;温迪·加勒特,柯蒂斯Huttenhower,跳过处女,和布鲁斯·沃克协议的建议和富有成果的讨论;和杰西卡的Hoisington洛佩兹测序的支持。这项工作是由比尔和梅琳达·盖茨基金会和NIAID(1R01AI111918)的支持。 DSK从宝来惠康基金获得更多的支持。 MNA由奖号T32GM007753从NIGMS,而保罗和黛西索罗斯奖学金支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表NIGMS或美国国立卫生研究院的官方意见。
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
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Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |