Marginating-hepatik lökosit seçici Hasat
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
karaciğer sinüsoidlerinden organizma için önemli çeşitli immün faaliyetleri pek çok lökosit alt tipleri içerir. Örneğin, aynı zamanda çukur hücreleri olarak bilinen hepatik marginating (MH), doğal katil (NK) hücreler, özelliği, morfolojik olarak büyük granüler limfositler (LGLs) ve fonksiyonel olarak kan-kurulmasına karşı hepatik-direnç sağlayan kendiliğinden sitotoksik kapasiteli lökositler gibi kaynaklı tümör metastazları. Burada sunulan yöntemin amacı bu önemli ve eşsiz hücre popülasyonu (ve bağışıklık bölmesi) araştırmak için MH lökositlerin selektif hasat, etkinleştirmek için, ve bu spesifik hücreler üzerinde çeşitli manipülasyonlar etkisini (örn bağışıklık aktivasyon) aydınlatmak etmektir.
Gelişmekte olan bir primer tümör ortadan kaldırmak için bağışıklık yetersizliği rağmen, kanser hastaları ve hayvan modellerinde kanıtlar bağışıklık sistemi tümör hücrelerini, mikro-metastazı ve Throu rezidüel hastalık sirkülasyon kontrol edilebileceğini gösterirgh hücre aracılı immünite (CMI). Bununla birlikte, in vivo özellikleri ve insanlarda in vitro çalışmalar, en otolog tümör hücrelerinin, dolaşımdaki veya dalak lökositleri 1,2 ile sitotoksisiteye karşı olduğunu göstermek hayvanlar, bu arasında açık bir tutarsızlık yoktur. Bu tutarsızlık, bir tat lökosit alt popülasyonuna, yani marginating-hepatik (sinüzoidler) lökosit ve aktive NK hücreleri, yani çukur hücre 3 kendi alt popülasyonunda in vivo varlığı, en azından kısmen, bağlı olabilir. Gerçekten de, laboratuar yayınlanmamış veriler F344 sıçanlarda singeneik dolaşan tümör hücrelerinin ve dalak lökositleri dirençli bulunmuştur (MADB106), MH-NK hücrelerinin 4 çözülmüştür göstermiştir. Bu nedenle, dolaşımdaki lökositlerin iddia edilen "NK dirençli" olarak tümör hücrelerinin MH NK hücreleri tarafından kontrol edilebilir. Dikkate değer olarak, farelerde MH-NK geliştirilmiş etkinliği sadece bağışıklık vivo aşağıdaki belirgindir(poli I kullanılarak, örneğin: Cı veya CpG-C) uyarma 5.
Karaciğer spesifik NK hücrelerinin (MH-NK) endotel hücreleri ve Kupffer hücreleri bağlı kalarak, sinüzoidal lümen içinde yer almaktadır. MH-NK hücreleri, sadece biyolojik olarak aktif madde 7,8 olarak lizozomal enzimler ve perforin ve granzymes gibi asit fosfataz içeren küresel yoğun granüller ve çubuk özlü veziküllerin 6, ile karakterize edilir. NK hücrelerini dolaşımdaki ile karşılaştırıldığında, MH-NK hücreleri granüller ve veziküller 9-11 daha yüksek bir sayı ve boyut sergilerler. NK hücrelerini dolaşım ile karşılaştırıldığında, inflamatuar koşullar altında, MH-NK hücreleri, LFA-1 12 daha yüksek ifadesini gösterir gösterildi. Bu geliştirilmiş ekspresyon MH-NK hücreleri, NK hücreleri 13,14 dolaşımdaki daha bazı tümör hücrelerine karşı daha fazla sitotoksik olan bir mekanizma oluşturabilir. nterestingly, interlökin (IL) -2 ile in vitro inkübasyondan sonra MH-NK hücrelerinin büyütülmüş hale gelir vebunların sayısı ve granül boyutu pro fi lenfokin ile aktive edilen katil (LAK) hücreler, 15 ile uyumlu olan, her biri, artar.
Aktif MH lökositler özel öğütme ve dokunun biyolojik bozunma göre standart karaciğer lökosit hasat yöntemleri ile elde edilemez. Burada tarif edilen Bizim perfüzyon yaklaşım standart yöntemlere göre iki önemli avantaja sahiptir. İlk olarak, perfüzyon yaklaşımı seçici diğer karaciğer bölmeleri diğer lökositler tarafından kirlenmeyi önleyerek, MH lökositleri hasadın. Doku işleme hasar hücreler yaklaşımların ya da morfolojisi değiştirmek ve doku hasarına bağlı, belirgin bağışıklık modüle çeşitli faktörlerin salınımını teşvik aksine İkincisi, daha iyi perfüzyon tekniği, bütünlük, aktivite ve MH lökositlerin fizyolojik ortamını korur aktivite.
karaciğer kanseri metastazı a için önemli bir hedef organdırnd çeşitli enfeksiyonlara 16. MH hücreleri benzersiz özelliklere sergilerler olarak patolojiler açısından çeşitli koşullar altında bu özel nüfus incelemek önemlidir. Örneğin, çeşitli BRM göre sistemik immün aktivasyon dikkat çekicidir (örneğin poli I: C veya CpG-C) lökosit 5 dolaşımdaki daha MH-lökositler fazla aktif olduğu gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan karaciğer perfüzyon yöntemi seçici bir hasat sağlar ve hepatik lökosit marginating benzersiz nüfusun incelenmesi. Ayrıca çukur hücreleri 3 olarak adlandırılan Karaciğer NK hücreleri, hepatik sinüzoitlerde ikamet farklı bir NK hücre popülasyonunu oluşturmaktadır. Bunlar, sıçanlar, fareler 17 ve insanlarda 18,19 bulunmaktadır. Izole edilmiş periferal NK hücreleri ile karşılaştırıldığında, çukur hücreleri küçük sitoplazmik granüllerin <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
