This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.
microscopia eletrônica de fractura por congelação tem sido uma técnica importante na investigação ultra-estrutural há mais de 40 anos. No entanto, a falta de meios eficazes para estudar a composição molecular de membranas produzido um declínio significativo na sua utilização. Recentemente, tem havido um grande avivamento em freeze-fratura de microscopia electrónica graças ao desenvolvimento de formas eficazes para revelar proteínas de membrana integrais através de uma rotulagem immunogold. Um destes métodos é conhecido como detergente solubilizado de fractura por congelação de réplica de imunomarcação (FRIL).
A combinação da técnica FRIL com Optogenetics permite uma análise correlacionada dos propriedades estruturais e funcionais de sinapses centrais. Usando esta abordagem, é possível identificar e caracterizar os neurónios tanto pré e pós-sinápticos, por sua respectiva expressão de um channelrodopsina marcados e marcadores moleculares específicos. A aparência distinta da especialização membrana pós-sináptica da Glutamatérgicos sinapses ainda permite que, mediante a rotulagem dos receptores de glutamato ionotrópicos, quantificar e analisar a distribuição intrasynaptic desses receptores. Aqui, damos uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para preparar réplicas emparelhados e como immunolabel eles. Também vamos discutir as advertências e limitações da técnica FRIL, em particular aqueles associados com potenciais vieses de amostragem. A elevada reprodutibilidade e versatilidade da técnica FRIL, quando combinado com Optogenetics, oferece uma abordagem poderosa para a caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro.
Aqui, nós fornecemos um exemplo de como esta abordagem foi utilizada para obter insights sobre relações estrutura-função de sinapses excitatórias em neurônios das massas de células intercaladas do amygdala mouse. Em particular, foi investigada a expressão de receptores de glutamato ionotrópicos nas entradas ou identificadosiginated do intralaminar posterior do tálamo e núcleos geniculados mediais. Essas sinapses foram mostrados para retransmitir a informação sensorial relevante para a aprendizagem medo e se submeter a mudanças plásticas no medo condicionado.
A definição da arquitectura funcional das biomembranas à escala nanométrica foi contestada nos últimos anos com o desenvolvimento de um número de técnicas de imunomarcação adequados para microscopia electrónica de transmissão. No entanto, estas técnicas, por exemplo, pré e imuno-incorporação de pós, têm um certo número de limitações importantes, que incluem pobre detecção de antigénios e / ou avaliação quantitativa limitado de proteínas ligadas à membrana. Estas limitações tornam-se particularmente crítico na investigação da estrutura fina do sistema nervoso, que é caracterizada por um elevado grau de diversidade e heterogeneidade celular sinapse. Esta heterogeneidade resultados de diversidade estrutural e funcional ditada pelos elementos pré- e pós-sinápticos e pela expressão diferencial, enriquecimento, ou a interacção de proteínas de sinalização, tais como receptores, transportadores, e moléculas efectoras.
Uma nova abordagem para immunolabe diretaling de proteínas de membrana integrais ou reticuladas em réplicas de fractura por congelação de detergente solubilizado (FRIL) foi originalmente introduzido pela Fujimoto há duas décadas 1. Este método original tinha, no entanto, várias limitações, ou seja, a fragmentação grave de réplicas, o que dificultava correlações significativas de moléculas marcadas com células mapeadas individualmente em tecidos complexos como o cérebro. Cerca de 10 anos atrás, Shigemoto e Fukazawa melhorou progressivamente a técnica 2. Esta foi acompanhada por esforços de outro grupo de cientistas dos laboratórios de Boulder da Universidade Estadual do Colorado, que também melhorou significativamente a técnica, em particular para o estudo das junções comunicantes 3.
A melhoria em protocolos de congelação-fractura e máquinas, bem como a introdução de congelação rápida (sob alta pressão), permite agora que os investigadores para produzir réplicas ininterrupta de espécimes de tamanho relativamente grande e oiimagens de qualidade gh da maioria dos componentes celulares sem as limitações e artefatos produzidos por fortes fixações químicas.
A técnica FRIL oferece a grande vantagem de uma altamente quantitativa na identificação in situ de um ou mais proteínas (simultaneamente) em histologicamente mapeadas e identificadas células citologicamente dentro dos tecidos complexos, tais como o cérebro, com a vantagem adicional de uma vista plana de pré- e pós-sináptico elementos em uma única réplica. Portanto, a técnica FRIL, apesar das suas muitas dificuldades técnicas, mantém a promessa de uma série de avanços científicos muito significativos, particularmente para a correlação de propriedades estruturais e funcionais de sinapses individuais. Durante as últimas décadas, uma grande quantidade de informações foi obtida sobre a estrutura, fazer molecular, e função fisiológica das sinapses; ainda sinapses são morfologicamente e molecularmente muito diverso, dependendo do pa pré e pós-sinápticaaluguer neurônios 4. Apenas por um punhado de tipos de sinapses eram estudos de estrutura-função feito até agora 5-7. Este foi principalmente devido a condicionalismos técnicos que impediram uma identificação precisa da natureza dos elementos pré e pós-sinápticos.
A análise ultra forneceu insights críticos sobre a variabilidade das especializações membrana pós-sináptica através de contatos sinápticos distintas, tanto em termos de tamanho sináptica e conteúdo em receptores de neurotransmissores 6, que tem um grande impacto sobre a força e a plasticidade da transmissão sináptica. Além disso, um grande corpo de pesquisa indica que o número de receptores de glutamato ionotrópicos expressos em diferentes tipos de sinapse é regulado de forma afferent- e meta-dependentes 7-10.
Aqui, um método é descrito que permite a análise da composição e estrutura do receptor da membrana pós-sináptica com especializações definirelementos pré-sinápticos d e função. Esta abordagem toma vantagem da expressão de pré-sináptica de proteínas sensíveis à luz recentemente desenvolvidos de algas, tais como Channelrhodopsin2 (ChR2), e da técnica FRIL para analisar o padrão de expressão pós-sináptico de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA-R) e N-metil-D-aspartato (NMDA-R) de receptores de glutamato. Isto é demonstrado nas sinapses formadas por axônios provenientes dos posteriores núcleos geniculados tálamo-mediais (PIN / MGN) em neurônios das massas de células intercaladas do amígdala (ITC). Neurónios ITC são células GABAérgicos espinhosas pequenas organizadas em aglomerados em torno do complexo amigdalóide basolateral (BLA) 11, 12. Neurónios ITC são conhecidos para receber entradas excitatórios de BLA principais neurónios e para atingir o núcleo central (CEA), funcionando, assim, como um portão inibidora para o fluxo de informações entre o BLA e CeA 12-15.
Recentemente, foi demonstrado que TINeurônios C localizados no cluster medio-dorsal entre BLA e CeA também recebem inputs excitatórios diretos e convergente de regiões corticais do tálamo e temporais sensoriais, que são modificados no medo aprendizado durante pavloviano auditivo medo condicionado 16. O condicionamento do medo é uma das formas mais bem compreendidos de aprendizagem associativa em termos de mecanismos cerebrais. Com medo condicionado, um estímulo condicionado inicialmente neutro (CS, por exemplo, um tom) está emparelhado com um estímulo aversivo incondicionado (US, por exemplo, um choque pé leve), resultando em uma associação CS-US e resposta de medo 17, 18 condicionado. Excitatórios entradas a partir de ambas as áreas do tálamo e neocorticais, que transportam informação que representa o CS e dos Estados Unidos, respectivamente, eram conhecidos por convergem para neurónios piramidais do núcleo lateral da amígdala (LA) e se submeter a plasticidade 19. Nosso trabalho anterior revelou que a informação entrada sensorial é também em paralelo retransmitida para os neurônios ITC <s-se> 16.
Como um primeiro passo para uma análise molecular mecanicista da entrada sensorial indivíduo sinapses em neurônios ITC, foi utilizado um vírus adeno-associado (AAV) para expressar ChR2 marcada com a proteína fluorescente amarela (YFP). O AAV foi injectado no PIN / MGN e os terminais de axónios foram identificados pela sua expressão de ChR2-YFP. Usamos ambas as faces geradas pela técnica FRIL para avaliar a densidade de pós-sinápticos AMPA-Rs e NMDA-R nas sinapses formados com ITC neurônios por terminais do axônio PIN / MGN.
microscopia eletrônica de fractura por congelação tem sido uma técnica importante na investigação ultra-estrutural há mais de 40 anos. No entanto, a falta de meios eficazes para estudar a composição molecular de membranas produzido um declínio significativo na sua utilização. Recentemente, tem havido um grande avivamento em microscopia electrónica de congelação-fractura, devido ao desenvolvimento de meios eficazes para revelar proteínas de membrana integrais por imunomarcação 1, 2, ou seja, a técnica de FRIL.
A técnica FRIL possui várias vantagens sobre outros métodos de ultra-estruturais imunomarcação. Em primeiro lugar, as proteínas são facilmente acessíveis aos anticorpos que aumentam a sensibilidade. Em segundo lugar, a exposição de grande porção de especializações da membrana plasmática, tal como a membrana pós-sináptica, sobre a superfície bidimensional da réplica permite a inspecção da distribuição espacial e de contiguidade física de moléculas de interesse sem reconstrução laborioso e demorado de seriseções al ultrafinos. Em terceiro lugar, a disponibilidade de ambas as metades da membrana plasmática aumenta o número de proteínas que podem ser marcados para cada estrutura individual, anticorpos adequados fornecidos estão disponíveis. Após a fractura, a face hidrofóbica da membrana de separação é revestida com carbono-platina que entrenches domínios de proteína restantes na superfície fracturada. Isso impede o acesso dos anticorpos aos antigénios nestes domínios. Por exemplo no P-face de uma réplica apenas epitopos de frente para o espaço protoplásmica pode ser detectada por anticorpos, ao passo que na E-cara somente epítopos de frente para o espaço exoplasmic pode ser ligado por anticorpos (ver Figura 2).
Por outro lado, a técnica FRIL também sofre de algumas limitações 2. Como as fraturas ocorrem aleatoriamente, pode ser difícil de atingir as células ou estruturas específicas. Isto pode também conduzir a um desequilíbrio da amostragem, por exemplo, na recolha de sinapse, tendo em conta a probabilidade de diferentes fracturing ao longo da membrana de estruturas com curvatura diferente (por exemplo, espinhas contra eixos). Além disso, a atribuição de proteínas de membrana a uma das duas faces é imprevisível. Por conseguinte, a distribuição de uma proteína com a P-face ou E-face, em particular para estudos quantitativos, devem ser cuidadosamente examinadas utilizando anticorpos reactivos com os domínios intracelulares e extracelulares. Finalmente, a identificação na réplica de certas estruturas, tais como terminais de axónios pré-sinápticos, pode ser difícil quando baseado apenas nas características morfológicas. No entanto, a utilização de anticorpos específicos para proteínas marcadoras ou a transdução de proteínas de membrana integrais etiquetadas ou canais que utilizam vectores virais oferece ferramentas adicionais para facilitar a identificação das membranas fracturados. Por exemplo, este estudo aproveitou a transdução de ChR2-YFP nos neurônios do tálamo para identificar seus eferentes axonal na amígdala ou a rotulagem para os receptores μ-opióides para revelar me pós-sinápticambranes de neurônios ITC.
A fim de executar a técnica FRIL com sucesso, um cuidado especial deve ser tomado a respeito fixação do tecido. fixação do tecido forte (> 2% paraformaldeído) pode resultar numa elevada taxa de fracturas transversais e uma diminuição na sensibilidade rotulagem. Por outro lado, as fixações fracos tornar o manuseamento e preparação do tecido (por exemplo, o corte de secções) difícil. Também é importante para controlar a espessura dos blocos aparadas corresponde à espessura da fita de dupla face. Se a espessura da amostra é menor do que a da fita, as superfícies do tecido não pode anexar à superfície dos dois transportadores de metal, consequentemente, a amostra congelada não se fracturou. Se o tecido é mais espesso, ele vai ser comprimido com distorções estruturais inevitáveis quando a sanduíche dos dois suportes de cobre é feito. A temperatura à qual a amostra é fraturado (neste protocolo, -115 ° C) desempenha também um papel importantena estrutura da réplica. Temperaturas mais elevadas podem produzir um aumento da taxa de artefactos, tais como a condensação de vapor de água na superfície do tecido antes ou durante a evaporação. Temperaturas mais baixas (<-125 ° C), podem aumentar o risco de cisão de material durante a fracturação. Este material pode cair sobre a superfície do espécime ou ficar ligado a ela. Estes flocos de material também são revestidos e contrastados produzindo manchas escuras na imagem. Fraturando a temperaturas mais baixas também pode afetar a frequência de cruzamento de fraturas especialmente para as pequenas estruturas finas como espinhas dendríticas. Um outro passo crucial na preparação das réplicas é a detergente-digestão. Se a digestão é incompleta, o tecido não digerido aparece como manchas escuras na réplica, confundindo a análise da estrutura ao MET. Além disso, o tecido não digerido pode anticorpos armadilha ou ligar não especificamente, aumentando a rotulagem de fundo. Por outro lado, o uso de detergentes para a digestão de tecido pode desnaturar as moléculas associadas à réplica de alterar as suas estruturas secundária e terciária. Portanto, para certos antigénios, pode ser necessário diluir gradualmente a concentração de SDS com passos de lavagem adicionais.
Para imunomarcação, a disponibilidade de diferentes tamanhos de partículas de ouro conjugadas com anticorpos secundários permite detectar, ao mesmo tempo, mas apenas qualitativamente, proteínas múltiplas, mesmo em microdomínios específicos da membrana do plasma, tais como a especialização pós-sináptica. No entanto, devido a impedimento estereoquímico, estudos quantitativos são geralmente limitados para a detecção de apenas uma molécula. O tamanho da partícula de ouro, também pode afectar a eficácia de rotulagem.
Para a interpretação da rotulagem em FRIL, deve-se ter em mente que a partícula imuno pode ser localizado em qualquer lugar dentro de um hemisfério com um raio de 20-25 nm do antigénio devido à forma complexa flexíveled pelo anticorpo primário e secundário 26. Para mais informações sobre a teoria e prática da FRIL e técnicas relacionadas, nós nos referimos o leitor também a outros artigos metodológicos 27, 28.
A técnica FRIL foi recentemente usada para a alta resolução de análises quantitativas de localização do receptor de glutamato em diversas populações sinapse 29, 30. Além disso, a sensibilidade de detecção da técnica FRIL para AMPA-R foi estimada tão elevada como uma partícula imuno por uma AMPA funcional canal -R 29. Assim, esta abordagem é em geral muito útil para quantificar e analisar o padrão de expressão pós-sináptico de AMPA e NMDA-Rs-Rs em sinapses centrais. Aqui, nós demonstramos a sua aplicabilidade nas sinapses PIN / MGN-ITC, um local mais provável importante para veicular a US informações durante o condicionamento do medo. Usando um anticorpo produzido contra os resíduos de aminoácidos extracelulares altamente conservadas das subunidades do receptor de AMPA GluA1-GluA4, encontramos uma distribuição uniforme de partículas de ouro nos pólos de IMP correspondentes a especializações membrana pós-sináptica. A densidade de AMPA-Rs em espinhas ITC foi significativamente maior em comparação com sinapses eixo alvo de PIN / MGN aferentes tálamo. Em ambas as coluna e eixo sinapses, foi detectada uma correlação positiva entre a rotulagem de AMPA-Rs e área de pós-sináptico, uma característica comum a outras sinapses glutamatérgicas 25. A baixa variação na densidade de AMPA-Rs no sinapses PIN / MGN-ITC indica uma distribuição homogênea semelhante a outras sinapses formadas por eferentes tálamo 7, mas diferente de sinapses corticais 25. Por outro lado, a densidade de NMDA-R foi mais variável e não diferiu entre coluna e eixo sinapses sugerindo uma regulação diferente do que AMPA-Rs. No futuro, a elevada reprodutibilidade da técnica FRIL não só irá permitir a avaliação da composição molecular basal de sinapses centrais, mas pode facilitar a detecção de cHanges em número de receptores ionotrópicos de glutamato e distribuição subsináptica Depois de aprender o medo, complementando ex-vivo gravações de propriedades de pré e pós-sinápticos desses insumos.
Em conclusão, esta abordagem poderia ser utilizado por outros investigadores para obter insights sobre relações estrutura-função de sinapses excitatórias específicos de entrada em muitos outros circuitos neurais em que desembaraçar a origem das entradas e da natureza e composição de elementos pós-sinápticos é fundamental, mas problemático .
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
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Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
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Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
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Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
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High-pressure Freezing | |||
Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
Chamois skin | Household supply store | ||
Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Aceton | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Freeze-fracture and Replication | |||
Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 – 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunolabelling | |||
BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
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EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAG5 | |
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAR15 | |
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EM analysis | |||
Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |