This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
遺伝的および生化学的ア プローチを組み合わせる能力は、 ショウジョウバエを生化学および分子生物学的研究1-3に特に適した生物を行いました。これらの研究は、多くの場合、大人のハエから、だけでなく、幼虫4、蛹5および胚6-8からだけでなく、生物学的材料を大量に必要とします。大量の材料を得るために、研究者は、フライ「人口ケージ」として知られている大きな容器を用いて培養ハエを持っています。これらのケージは、ハエが逃げることなく、ケージの中に食品の導入を可能にするために、両側のネットで覆われたプラスチック製の円筒で構成されています。これらのケージは、(特定の材料/機器の表を参照)9-11自家製や会社から購入することができます。
ハエの大量の成長を、このシステムを使用することの主な利点は、果物のサイクル12を飛ぶすべてのハエは、再で開発する方法で制御することができるということですlatively方法を同期。この同期は、新しい胚を播種幼虫/ハエを供給し、正確な時刻に大人のハエを犠牲にすることによって達成されます。同期ハエ集団を使用すると、発生研究13のために特に有用です。
いくつかのハエからの新しい人口ケージの開始が増幅9-11の多くのサイクルを必要とする時間のかかるプロセスです。でもフライ培養ボトルまたはminicagesのような大きなコンテナを使用して、全体のプロセスは数ヶ月続くことができます。ステップを消費し、この時間を回避するために、多くのショウジョウバエの研究室は、定期的に、このようなケージを維持します。すでに確立された人口ケージから胚コレクションから始まる新しいケージを開始することが最も便利です。一般的に、ほとんどのラボではこの原稿がフライ人口ケージを維持するための詳細なプロトコルを提示するようにオレゴンRやカントンSなどの野生個体群のケージを、維持します。
材料1の1.5グラムで起動すると、サイクルごとに7と13グラムの間に収集された胚の収率を得ることができます。そのような材料の量を得るためには、フライサイクルのすべての段階のための右の培養条件を維持することが重要です。
最も重要なパラメータは、それぞれ、24ºC35%であるべきである温度及び湿度です。これら2つのパラメータは、実験室の通常の環境下で一定に保つことができない場合、一つの可能性は、インキュベータまたは環境室にフライケージを配置することであろう。他のプロトコルは産卵9,10の収量を増加させるために70%の湿度も一定の24時間の明暗サイクルをお勧めします。しかし、35%の周りの湿度を維持することは細菌汚染を回避し、このプロトコルの目的は、人口のケージのメンテナンスだけであるため、ハエは、ラボの通常の光環境に保存されています。
もう一つ重要な点は、ジを維持することです大人へのsturbancesはできるだけ低く飛びます。他のハエからの交差汚染を避けるために、フライ部屋から別の場所にケージを保つことが望ましいことがあります。
それは彼らの純度を維持するために、彼らは大規模な人口ケージ14に顕著な異常な交尾行動を示すことが非常に困難であるため、トランスジェニックおよび変異ハエの大集団の培養は、推奨されません。
一つの可能性のある問題は、大量にショウジョウバエを培養しながら、食品のために競うため、生産卵の収量を減少させるダニおよび/ またはカビのような他の生物の存在です。これを避けるために、きれいなすべての機器を維持するために非常に重要であるケージを洗浄し、ネット、水と石鹸でボックスを飛ぶし、すべてのサイクルの後に使い捨て材料(発泡栓)を廃棄します。ステップにおいてフライ食品を製造する場合、金型成長を減少させるために、プロピオン酸およびリン酸が湿潤酵母に添加します1.2とTegoseptステップ3.1で糖蜜トレイを準備します。時間が短く、材料はすぐに洗浄することができないときに-20℃で、このようなプラスチックの箱や篩などの材料を配置することも、役に立つ場合があります。
胚はフライボックスに播種し、最後の収集日で終了したときに開始、15日 – コレクション全体のサイクルが14で起こります。この間、プロトコルセクションで詳述人口フライケージ( 図2)、の維持に必要なすべてのステップを覚えておくために、スケジュールを整理することをお勧めします。成虫が出現するまで卵は、播種することを日から、唯一のプラスチックの箱を検査する必要があり、蛹化が発生したときに、ケージの内側に配置します。胚は新しいサイクルのために播種するまで3日 – その後、ハエは、すべての2を供給しなければなりません。全体のプロトコルでは、最も長い日が新しいサイクルを開始するための胚の収集および播種の間にあります。 A5日大人の羽化後、最後に2日後に低下 – プロトコルにコメント秒、最高の卵の収量は3です。これは、卵の収穫が実行される中で一日を選択するために私たちにいくつかの柔軟性を提供します。
収集された胚の収率は所望の出発量(1.5グラム)未満の何らかの理由により、1は常に新しい糖蜜トレイを追加し、次の日より多くの卵を集めることができます。一定のコレクションのために、並列に2ケージを維持するために推奨され、そして胚のより高い量が必要な場合、また、大きなケージを使用することが可能です。短時間のコレクションを行う場合には、収量を増加させる一つの方法は、午前中に産卵バーストを利用することです。
種々の発生段階を大量に収集する多くの利点があります。例えば、人口のケージから収集した胚は、免疫沈降アッセイ6-8、質量collectioで非常に首尾よく使用されてきました解離した幼虫から幼虫組織のnが3C実験4およびRNA調製15のための非常に良い源であることが実証されていて、大人のハエからのヘッドはChIP実験16のために利用されてきました。また、成人は、しばしば、組織培養用17ハエ抽出物を作るために必要とされます。
ケージの最も有望な用途の一つは、病原体、生体分子、化学物質及び電離放射線の暴露に応答した遺伝子、転写産物、タンパク質および代謝産物の分析及びスクリーニングを可能にするハイスループットアッセイのための材料を提供することにあります。これらの大規模アッセイにおいて個体の多数が必要とされており、ここで説明するハエ集団ケージは、その分析およびスクリーニング18のためのショウジョウバエのライフサイクルの異なる段階中に材料の大きな量を得るために非常に有用であることができます。
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |