This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
היכולת לשלב גישות גנטיות ביוכימיים הפכה תסיסנית אורגניזם מתאים במיוחד ללימודי ביולוגיה ביוכימיה מולקולרית 1-3. מחקרים אלו לעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של חומר ביולוגי, לא רק זבובים בוגרים, אלא גם מן הזחלים 4, גלמים 5 ועובר 6-8. כדי להשיג כמויות גדולות של חומר, יש חוקרים זבובים בתרבית באמצעות מיכלים גדולים המכונים לעוף "כלובי אוכלוסייה". כלובים אלה כוללים גליל עשוי פלסטיק מכוסה ברשת משני הצדדים כדי לאפשר כניסתה של המזון בתוך הכלוב ללא זבובים לברוח. כלובים אלה יכולים להיות תוצרת בית 9-11 או נרכש מחברה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי).
היתרון העיקרי של השימוש במערכת זו לגדול במספרים גדולים של זבובים הוא כי מחזור של זבוב הפירות 12 ניתן לשלוט בצורה כל הזבובים להתפתח מחדשlatively מסונכרן באופן. סנכרון זו מושג על ידי זריעת עוברים חדשים, האכלת זחלים / זבובים להקריב את הזבובים הבוגרים בזמנים מדויקים. באמצעות אוכלוסיית זבובים מסונכרנת שימושי במיוחד עבור מחקרים התפתחותיים 13.
תחילת כלוב אוכלוסייה חדש בין כמה זבובים היא תהליך גוזל זמן מחייב מחזורים רבים של הגברת 9-11. אפילו באמצעות מכולות גדולות כמו בקבוקי תרבות זבוב או minicages, התהליך כולו יכול להימשך חודשים. כדי להימנע הפעם רב צעד, מעבדות תסיסנית רבות באופן קבוע לשמור כלובים כאלה. זה הכי נוח להתחיל כלוב חדש החל אוסף העובר מן כלוב אוכלוסייה כבר הוקם. באופן כללי, רוב מעבד לשמור כלובי אוכלוסיית wildtype, כגון אורגון R או קנטון ס כתב יד זה מציגה פרוטוקול מפורט לשמור כלובי אוכלוסיית זבובים.
החל עם 1.5 גרם של אחד חומר יכול להשיג תשואה של עוברים שנאספו בין 7 ו -13 גרם לכל מחזור. כדי להשיג סכום כזה של חומר זה הוא חיוני כדי לשמור על תנאי culturing התקינים לכל שלבי מחזור הזבוב.
הפרמטרים החשובים ביותר הם טמפרטורה ולחות, אשר אמור להיות 24 ºC ו -35% בהתאמה. אם שני פרמטרים אלה לא ניתן לקיים קבועים בסביבה הרגילה של המעבדה, אפשרות אחת תהיה להציב את הכלוב לטוס לתוך חממה או בתא סביבתי. פרוטוקולים אחרים ממליצים לחים 70% וגם מחזור אור חושך קבוע 24 שעות כדי להגדיל את התשואה של הביצים המיוצרות 9,10. עם זאת לשמור על הלחות סביב 35% ימנע זיהום חיידקים, ומאז מטרת פרוטוקול זה היא רק החזיק כלוב אוכלוסייה, הזבובים נשמרים בסביבה באור הרגילה של המעבדה.
נקודה חשובה נוספת היא לשמור disturbances למבוגר טס נמוך ככל האפשר. זה עשוי להיות כדאי לשמור על הכלוב במיקום נפרד מהחדר לטוס כדי למנוע זיהום צולב מפני זבובים אחרים.
Culturing של אוכלוסיות גדולות של מהונדס וזבובי מוטציה אינו מומלץ, שכן הוא מאוד קשה לשמור הטוהר שלהם והם יכולים להפגין התנהגות חיזור חריגה בולטת בכלובי אוכלוסייה גדולים 14.
אחת בעיות האפשר תוך culturing תסיסנית בכמויות גדולות הוא הנוכחות של אורגניזמים אחרים כמו קרדית ו / או עובש, אשר יתחרו על האוכל ועל כן להפחית את התשואה של ביצים מיוצרות. כדי למנוע זאת, חשוב מאוד לשמור את כל הציוד נקי, שטיפת הכלוב, רשתות ולעוף תיבות עם מים וסבון, ולהשאיר את החומר הפנוי (אטמי קצף) לאחר כל מחזור. כדי להקטין עובש גדל, propionic וחומצה זרחתית מתווספים לתוך שמרים רטובים בעת הכנת אוכל לטוס בשלב1.2 ו Tegosept בעת עריכת מולסה מגש בשלב 3.1. לפעמים זה מועיל חומרי מקום כמו קופסת פלסטיק או הנפות ב -20 C כאשר הזמן קצר וחומרים לא ניתן לנקות מיד.
מחזור אוסף שלם מתרחש ב -14 – 15 ימים, החל כאשר עובר הם זורעים לתוך התיבה לטוס וכלה היום האוסף האחרון. במהלך פרק זמן זה, מומלץ לארגן לוח זמנים על מנת לזכור את כל הצעדים הדרושים לשמירה על כלוב אוכלוסיית הזבובים (איור. 2), מפורטים בפרק פרוטוקול. מהיום שהביצים הם זורעים, עד זבובים בוגרים לצאת, יש צורך רק כדי לבדוק את קופסת פלסטיק, וכאשר התגלמות מתרחשת, כדי למקם אותם בתוך הכלוב. לאחר מכן, הזבובים צריכים להיות מוזנים כל 2 – 3 ימים עד עובר הם זורעים עבור מחזור חדש. בפרוטוקול כולו, היום הארוך ביותר הוא במהלך איסוף זריעה של עוברים החל מחזור חדש. אs הגיב בפרוטוקול, תשואת הביצה הטובה ביותר היא 3 – 5 ימים לאחר eclosion המבוגר, ולבסוף יורדת 2 ימים לאחר מכן. זה נותן לנו גמישות מסוימת כדי לבחור את היום שבו הקציר של הביצים יבוצע.
אם מסיבה כלשהי את התשואה של עוברים שנאספו היא פחות מהסכום החל הרצוי (1.5 גרם), תמיד אפשר להוסיף מגש מולסה חדש ולאסוף יותר ביצים למחרת. אוספים מתמיד, מומלץ לשמור על 2 כלובים במקביל, ואם כמויות גבוהות של עוברים נדרשים, הוא גם אפשרי להשתמש בכלובים גדולים. במקרה של עשיית אוספים זמן קצר, אחת הדרכים להגדיל את התשואה היא לנצל את פרץ ההטלה בבוקר.
ישנם יתרונות רבים של איסוף כמויות גדולות של שלבי התפתחות שונים. לדוגמה, עוברים שנאספו מהכלובים האוכלוסייה שימשו בהצלחה מאוד מבחני immunoprecipitation 6-8, collectio המוניתn של רקמות זחל זחלים ניתקים הוכיח להיות מקור טוב מאוד עבור 3C ניסויים 4 והכנות RNA 15, וראשים מ זבובים בוגרים כבר נוצל לניסויי שבב 16. בנוסף, מבוגרים בדרך כלל יש צורך להפוך תמציות לטוס עבור בתרבית רקמה 17.
אחד היישומים המבטיחים ביותר של הכלוב הוא לספק חומר עבור מבחני תפוקה גבוהה המאפשרים ניתוח והצגה של גנים, תעתיקים, חלבונים מטבוליטים בתגובה לחשיפת פתוגנים, מולקולות ביולוגיות, חומרים כימיים וקרינה מייננת. מבחני בקנה מידה גדול אלה מספר גדול של אנשים נדרשים, ואת הכלוב אוכלוסיית הזבובים המתואר כאן יכול להיות מועיל מאוד כדי להשיג כמויות גדולות של חומר במהלך השלבים השונים של מחזור החיים תסיסנית לניתוח שלהם ההקרנה 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
Molasses | Grandma´s | ||
Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
Plastic film | Glad | ||
Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
Sucrose | MP | 152584 | |
Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |