أنشأنا تقنية لعزل وتوصيف المظهري والتحليل الوظيفي للخلايا المناعية من اللثة الفئران.
Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.
أنسجة اللثة المحيطة البشرية والأسنان الفئران ويتعرضون باستمرار لبيوفيلم معقد من الأسنان 1. شبكة الخلايا المناعية الشرطة على حاجز اللثة أمر حيوي للحفاظ على سلامة الأنسجة، وضمان التوازن مع الميكروبات المتعايشة المحلية و، في نفس الوقت، وتوفير حصانة فعالة ضد التحدي الإمراض 2. لتحقيق التوازن، تم تصميم جهاز المناعة بعناية للبيئة اللثة خلق درجة عالية من التخصص، شبكة الخلايا المناعية، ولكن كما هو معروف التفاصيل الصغيرة من السكان الخلايا المناعية اللثة ودورها في الحفاظ على مناعة الأنسجة 2.
عندما تتعطل توازن المناعة في اللثة، إما من خلال زيادة قابلية المضيف و / أو وجود المجتمعات الميكروبية dysbiotic، وهو حالة التهابية، اللثة تنشأ 3 4. التهاب اللثة هو مرض التهابي المشترك، مما يؤدي إلى فقدان الأسنان الصورةهياكل upporting. وينظر في أشكاله الشديدة في ما يقرب من 10٪ من عموم السكان 5. وقد ثبت تشريح العوامل الرئيسية المشاركة في حساسية اللثة والتقدم الصعب 6. ومع ذلك، فإن نماذج حيوانية مفيدة للغاية في فهم آليات بدء اللثة وتقدم 7. نماذج يمكن استخدامها لتحديد السكان الخلية الرئيسيين والوسطاء الجزيئية التي تعد حيوية للحفاظ على توازن المناعة وتطوير محرك اللثة. وهذه فكرة تحويل فهمنا لضبط اللثة محددة من توازن المناعة وتزيد من فهمنا الحالي للإمراض المرض.
هذه التقنية الحالية غلة بنجاح عددا كبيرا من الخلايا المناعية (من ماوس واحدة) مناسبة، ليس فقط لتوصيف المظهري، ولكن أيضا للدراسات وظيفية خارج الحي. ان مجموعة اخرى تنطبق على بروتوكول لعزل وتوصيف الخلايا المناعية اللثة الفئران وعرض قيمة استخدام متعدد الألوان التدف…
The authors have nothing to disclose.
Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.
Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27G, 12.7 mm length |
Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3mL |
PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
0.5M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
50 mL tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
5 mL FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |