Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
Équido herpesvirus-2 (EHV-2) está involucrado en un síndrome respiratorio, con posibles manifestaciones clínicas tales como la secreción nasal, faringitis y ganglios linfáticos inflamados 1-3. Este virus también es sospechoso de estar asociado con el pobre rendimiento de los caballos, que puede resultar en un impacto económico significativo y negativo para la industria del caballo 2.
Hasta ahora, el estándar de oro para gamma-EHV (γ-EHV) de detección fue el método de cultivo celular. El primer inconveniente de este procedimiento fue la ausencia de discriminación entre EHV-2 y otra γ-EHV (por ejemplo, EHV-5). El segundo inconveniente fue el lento desarrollo del proceso citopático, lo que lleva de 12 a 28 días para manifestar 4,5.
Desarrollo de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real validado y normalizado (QRT-PCR) método ayudará a detectar rápidamente el virus, para discriminar entre EHV-2 y EHV-5 y para estudiar la relación entre la carga genoma viral y la enfermedad gracias al aspecto cuantificación.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue descrito por primera vez en 1986 por Mullis 6 y está a punto de convertirse en el nuevo estándar de oro en la mayor parte de los campos de diagnóstico biológico (humana, el medio ambiente y veterinaria). Este método, que se basa en la amplificación de una parte del genoma de agentes patógenos, presenta muchas ventajas: especificidad, sensibilidad y rapidez. Por otra parte, el riesgo de contaminación amplicón retrocedió desde el advenimiento de QRT-PCR y control de calidad 7. Sin embargo, el reconocimiento de la PCR como un nuevo método estándar de oro necesaria más que la mejora de los datos de rendimiento, sino también la demostración del control de desarrollo y validación pasos de todo el método sin degradación del rendimiento con el tiempo.
Las primeras herramientas moleculares utilizados para la detección de EHV-2 fueron el tiempo cla amplificación no específica onsuming e involucrado con la PCR anidada seguido por 8 de secuencia. Los genes específicos de los virus del herpes fueron el ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerasa y DNA embalaje 9. Sin embargo, la PCR anidada presenta un alto riesgo de contaminación por amplicones. Desde entonces, las pruebas de PCR convencionales han sido diseñados para amplificar la interleucina gen 10 o de tipo B gen de la glicoproteína, revisado en 2009 2. Más recientemente, se han descrito las características de PCR en tiempo real para la cuantificación de EHV-2 10, pero no hubo datos disponibles en relación con la validación de todo el método que incluye el proceso de extracción.
En este protocolo, se describen los procedimientos de desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para la detección y cuantificación de ADN de EHV-2 en los fluidos respiratorios equino de acuerdo con la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) norma NF U47-600 3,11,12, que es el representante francés enla comisión de normalización internacional. Esta norma detalla los "Requisitos y recomendaciones para la implementación, desarrollo y validación de PCR veterinaria en el método de análisis de la salud animal" 11,12, según la norma NF EN ISO / CEI 17025 de 2005 y 13 de la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) . recomendaciones de 2010 14 el protocolo de validación de QRT-PCR EHV-2 implica un procedimiento de tres partes: (a) el desarrollo de la QRT-PCR ensayo, (b) la caracterización de QRT-PCR ensayo solo y (c) la caracterización de la totalidad método analítico (de extracción de ácidos nucleicos de la muestra biológica para el análisis de PCR).
La caracterización de la QRT-PCR ensayo y del método de análisis conjunto incluye la definición de dos límites: el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). El LOD 95% PCR representa el menor número de copias de ácido nucleico por unidad de volumen que se pueden detectar en el 95% de todos los casES. El límite de cuantificación del 95% de PCR representa la menor cantidad de copias de ácidos nucleicos que pueden determinarse teniendo en cuenta las incertidumbres.
Este método QRT-PCR permite la detección precisa y rápida cuantificación de EHV-2 en los fluidos respiratorios. Además, el método se podría aplicar en otros laboratorios para garantizar un procedimiento estandarizado y plantilla como general para el desarrollo de otros nuevos ensayos de QRT-PCR.
Desde la década de 2000, PCR en tiempo real ha estado reemplazando las técnicas estándar de oro (cultivo celular y los métodos de cultivo de bacterias) en un número creciente de laboratorios. Aplicación de la técnica es relativamente fácil. Sin embargo validación de métodos de laboratorio es esencial para la detección y cuantificación molecular de patógenos para asegurar que los datos precisos, repetibles y fiables.
Desde la etapa de extracción es la fuente principal de pérdida de material biológico, se puede considerar la principal fuente de error de cuantificación entre un protocolo y otro. Como tal, la creación de una curva estándar de plásmido de ADN durante la qRT-PCR, informado principalmente en la literatura, indica la carga viral del genoma, pero no tiene en cuenta la etapa de extracción.
Descripción de una estrategia de novo para un proceso de validación del método en toda la norma AFNOR NF U47-600-2 representa un avance significativo en esta área. Como se ilustra eneste documento para EHV-2 en caballos, o por otras abejas 21, esto requiere una clara diferenciación entre la etapa de desarrollo y la etapa de validación de la caracterización de la PCR y caracterización de todo el método. Una limitación de este enfoque interesante es que cualquier cambio en el protocolo dará lugar a la obligación de revalidar el proceso completo que podría ser muy costosa. Esta limitación también se puso de relieve por el hecho de que los límites de cuantificación dependen de la fuente de la que el virus se extrae (por ejemplo, los fluidos respiratorios, órganos, sangre u orina). De hecho, cada matriz presenta diferentes especificidades en sus características físico-química, y es importante para definir independientemente cada matriz diferente utilizado para la detección y cuantificación viral mediante qRT-PCR. Por lo tanto, la carga viral del genoma de cada muestra biológica se puede cuantificar con mayor precisión de la extracción. La caracterización también tiene en cuenta el mod termocicladorEL y cuando el uso de un método previamente bien caracterizado (por ejemplo, el método de qPCR EHV-2 se describe en este documento) requiere un nuevo tipo de máquina en el laboratorio de los padres u otro laboratorio, hay que confirmar el funcionamiento de ese instrumento. La confirmación de los resultados de un ensayo de qPCR es un requisito previo para todas las pruebas poner en un laboratorio. Esto se consigue normalmente mediante el análisis de una muestra de referencia con propiedades conocidas. Esta comprobación es un requisito obligatorio y considerado conforme a lo solicitado por la norma NF 47-600-1 AFNOR con el fin de validar el funcionamiento de la (eficiencia LOD, LOQ) qPCR y la solidez de todo el método (LOD, LOQ). No sólo durante las etapas de desarrollo y la caracterización, sino también cuando se utilizan en investigación o con fines de diagnóstico, los factores de riesgo pueden ser identificados y bien controlados para asegurar la normalización del protocolo. De particular preocupación es la formación del personal adecuado, con personal altamente calificado, el control de calidad de los consumiblesutilizados y su almacenamiento, el control de las condiciones ambientales inmediatos y conocimiento de las condiciones metrológicas que pueden afectar el rendimiento de los instrumentos científicos que participan en el ensayo. El uso de muestras de referencia para las comparaciones entre laboratorios también podría ayudar a controlar las incertidumbres. De esta manera, la comparación de datos entre laboratorios puede ser facilitada. De hecho, las pruebas de competencia entre laboratorios son esenciales para evaluar y confirmar la reproducibilidad del método.
resultados de la carga viral del genoma que se expresan en unidades internacionales (UI) de la matriz biológica analizada (UI: copias / ml para líquidos o copias / g para los tejidos) son más fáciles de utilizar con el fin de comparar los resultados entre diferentes laboratorios. Todos los resultados anteriores el límite de cuantificación se expresan como copias / ml y el resultado entre el LD y LC se toma como un resultado positivo no cuantificables. La presentación de datos cuantificacionales del genoma de esta manera se ajusta con mayor precisión a los process de análisis (amplificación del genoma). De hecho, en experimentos de cultivo celular, la expresión de la carga viral por TCID 50 (tejido mediana cultura dosis infecciosa) depende de la naturaleza de las células y cepas de virus. Cada línea cepa posee su cinética de infección únicos y algunos virus como el EHV-2 puede tomar varios días antes de que el primer efecto citopatogénico es evidente.
En conclusión, este nuevo método de caracterización de QRT-PCR debe facilitar la armonización de la presentación e interpretación de datos entre laboratorios. Esto será muy útil para posibles nuevas aplicaciones de QRT-PCR en el futuro como el establecimiento de un valor de corte para la declaración del estado de la enfermedad en lugar de simplemente la presencia o ausencia del patógeno.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
Primers | Eurofins | Custom order | |
Probe | Life Technologies | Custom order | |
Plasmid | Eurofins | Custom order | |
QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |