Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
Equid herpesvirus-2 (EHV-2) est impliqué dans un syndrome respiratoire, avec des manifestations cliniques potentielles telles que l' écoulement nasal, la pharyngite et des ganglions lymphatiques enflés 1-3. Ce virus est également soupçonné d'être associé à la mauvaise performance des chevaux, ce qui peut entraîner un impact économique significatif et négatif pour l'industrie du cheval 2.
Jusqu'à présent, l'étalon-or pour le gamma-EHV (γ-EHV) la détection a été la méthode de culture cellulaire. Le premier inconvénient de cette procédure était l'absence de discrimination entre EHV-2 et d' autres γ-EHV (par exemple EHV-5). Le second inconvénient est la lenteur du développement du processus cytopathologique, qui prend de 12 à 28 jours pour manifester 4,5.
Élaboration d'un temps réel de réaction en chaîne par polymérase quantitative validée et normalisée (qRT-PCR) permettra de détecter rapidement le virus, afin de discriminer entre EHV-2 et EHV5, et d'étudier la relation entre la charge du génome viral et la maladie grâce à l'aspect de quantification.
Réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été décrite pour la première fois en 1986 par Mullis 6 et est sur le point de devenir la nouvelle norme d'or dans la plupart des domaines du diagnostic biologique (humaine, l' environnement et vétérinaire). Cette méthode, qui est basée sur l'amplification d'une partie du génome d'agents pathogènes, présente de nombreux avantages: la spécificité, la sensibilité et la rapidité. En outre, le risque de contamination de l' amplicon a reculé depuis l'avènement de qRT-PCR et l' assurance de la qualité 7. Néanmoins, la reconnaissance de la PCR comme une nouvelle méthode de l'étalon-or a nécessité plus qu'une simple amélioration des données de performance, mais aussi la démonstration du contrôle du développement et de validation des étapes du procédé entier sans dégradation des performances au fil du temps.
Les premiers outils moléculaires utilisés pour la détection de EHV-2 ont été temps camplification non spécifique onsuming et impliqué dans la PCR nichée suivie d' un séquençage 8. Les gènes ciblés pour les virus de l' herpès sont l' acide désoxyribonucléique (ADN) polymérase et l' ADN emballage 9. Cependant, la PCR nichée présente un risque élevé de contamination par des amplicons. Depuis lors, les tests PCR conventionnels ont été conçus pour amplifier l'interleukine gène 10-like ou gène de la glycoprotéine B, révisé en 2009 2. Plus récemment, les caractéristiques de PCR en temps réel ont été décrits pour la quantification de EHV-2 10 mais aucune donnée étaient disponibles relatives à la validation de la méthode incluant l'ensemble du processus d'extraction.
Dans ce protocole, les procédures de développement et de validation sont décrits pour une méthode PCR quantitative pour la détection et la quantification de EHV-2 ADN dans les fluides respiratoires équins selon l'Association française de normalisation (AFNOR) norme NF U47-600 3,11,12, qui est le représentant françaisle comité international de normalisation. Cette norme détaille les «Exigences et recommandations pour la mise en œuvre, le développement et la validation de PCR vétérinaire animale méthode d'analyse de la santé» 11,12, selon la norme NF EN ISO / CEI 17025 2005 13 et à l' OIE (Organisation mondiale de la santé animale) . recommandations 2010 14 le qRT-PCR protocole de validation EHV-2 implique une procédure en trois parties: (a) le développement du dosage qRT-PCR, (b) la caractérisation de l' essai qRT-PCR seul et (c) la caractérisation de l'ensemble méthode analytique (provenant de l'extraction des acides nucléiques de l'échantillon biologique pour l'analyse PCR).
La caractérisation de l'essai qRT-PCR et de toute méthode d'analyse comprend la définition de deux limites: la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LQ). La limite de détection de 95% PCR représente le plus faible nombre de copies d'acide nucléique par unité de volume qui peuvent être détectés dans 95% de tous les NCAes. La LQ 95% PCR représente la plus faible quantité de copies d'acides nucléiques qui peuvent être déterminés en tenant compte des incertitudes.
Cette méthode qRT-PCR permet la détection précise et la quantification rapide de EHV-2 dans les fluides respiratoires. En outre, le procédé peut être appliqué dans d'autres laboratoires afin d'assurer une procédure normalisée et un modèle général pour que le développement d'autres nouveaux tests qRT-PCR.
Depuis les années 2000, la PCR en temps réel a été de remplacer les techniques d'or standard (culture cellulaire et des méthodes de culture de bactéries) dans un nombre croissant de laboratoires. La mise en oeuvre de cette technique est relativement facile. Cependant la validation des méthodes de laboratoire est essentiel pour la détection moléculaire et la quantification des agents pathogènes pour garantir des données précises, reproductibles et fiables.
Etant donné que l'étape d'extraction est la principale source de perte de matière biologique, elle peut être considérée comme la principale source d'erreur de quantification entre un protocole et un autre. A ce titre, la création d'une courbe standard de l'ADN du plasmide au cours de la qRT-PCR, principalement dans la littérature, indique que la charge du génome viral, mais ne tient pas compte de l'étape d'extraction.
Description d'une stratégie de novo pour tout un processus de validation de la méthode dans la norme AFNOR NF U47-600-2 représente un progrès significatif dans ce domaine. Comme cela est illustré dansce document pour EHV-2 chez les chevaux, ou par d' autres dans les abeilles 21, cela nécessite une différenciation claire entre l'étape de développement et de l'étape de validation avec la caractérisation de la PCR et la caractérisation de toute la méthode. Une limitation de cette approche intéressante est que tout changement dans le protocole se traduira par l'obligation de revalider le processus complet qui pourrait être très coûteux. Cette limitation a été également mis en évidence par le fait que les limites de quantification dépendent de la source à partir de laquelle le virus est extrait (par exemple, des fluides respiratoires, les organes, le sang ou l' urine). En effet, chaque matrice présente des spécificités différentes, dans leurs caractéristiques physico-chimiques et il est important de définir, indépendamment dans chaque matrice différente utilisée pour la détection et la quantification virale par qRT-PCR. Ainsi, la charge du génome viral de chaque échantillon biologique peut être quantifiée plus précisément à partir de l'extraction. La caractérisation prend également en compte le mod thermocycleurel et quand l'utilisation d'une méthode précédemment bien caractérisé (par exemple, la méthode EHV-2 qPCR décrite dans cet article) nécessite un nouveau type de machine dans le laboratoire de parent ou d' un autre laboratoire, il faut confirmer l'efficacité de cet instrument. La confirmation de l'exécution d'une analyse qPCR est une condition sine qua non pour tous les tests mettent en laboratoire. Ceci est normalement obtenu par l'analyse d'un échantillon de référence possédant des propriétés connues. Un tel contrôle est une condition préalable et considéré obligatoire tel que demandé par la norme NF 47-600-1 AFNOR afin de valider la performance du (efficacité LOD, LOQ) qPCR et la robustesse de toute la méthode (LOD, LOQ). Non seulement pendant les étapes de développement et de caractérisation, mais également lorsqu'ils sont utilisés dans la recherche ou à des fins de diagnostic, les facteurs de risque peuvent être identifiés et bien contrôlées pour assurer la normalisation du protocole. Il est particulièrement préoccupant formation adéquate du personnel, du personnel hautement qualifié, le contrôle de la qualité des consommablesutilisés et leur stockage, le contrôle des conditions environnementales immédiates et de sensibilisation des conditions métrologiques qui peuvent affecter la performance des instruments scientifiques impliqués dans le dosage. Utilisation d'échantillons de référence pour les comparaisons inter-laboratoires pourrait aussi aider à contrôler les incertitudes. De cette manière, la comparaison des données entre les laboratoires peut être facilitée. En effet, des essais inter-laboratoires sont indispensables pour évaluer et confirmer la reproductibilité de la méthode.
Résultats de la charge du génome viral qui sont exprimées en unités internationales (UI) de la matrice biologique analysé (UI: copies / ml pour des fluides ou des copies / g pour les tissus) sont plus faciles à utiliser afin de comparer les résultats entre différents laboratoires. Tous les résultats ci-dessus la LQ sont exprimés en copies / ml et un résultat entre le LOD et LOQ est considéré comme un résultat positif non quantifiable. La présentation des données quantificationnels du génome de cette manière est plus conforme précisément aux procès-s d'analyses (amplification du génome). En fait, dans des expériences de culture cellulaire, expression de la charge virale par TCID 50 (tissu médiane culture infectieuse dose) est fonction de la nature des cellules et des souches de virus. Chaque ligne de souche possède sa cinétique d'infection uniques et certains virus comme EHV-2 peuvent prendre plusieurs jours avant le premier effet cytopathogène est apparente.
En conclusion, cette nouvelle méthode de caractérisation des qRT-PCR devrait faciliter l'harmonisation de la présentation des données et l'interprétation entre les laboratoires. Ce sera très utile pour de nouvelles applications potentielles de qRT-PCR à l'avenir, comme la mise en place d'une valeur de coupure pour la déclaration de l'état de la maladie au lieu de simplement la présence ou l'absence de l'agent pathogène.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
Primers | Eurofins | Custom order | |
Probe | Life Technologies | Custom order | |
Plasmid | Eurofins | Custom order | |
QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |