Summary

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Published: January 25, 2016
doi:

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Кожные начиная от контактного дерматита, экземы, псориаз, целлюлит, грибковых инфекций и абсцессов к раку кожи немеланомных оказались среди 50 самых распространенных заболеваний во всем мире, и четвертый ведущий мировой причиной несмертельных болезней в 2010 году 1. Соответственно, исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе различных патологий кожи является необходимым и активной областью исследований. Моделях грызунов были чрезвычайно полезны в понимании воспалительных заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз 2 3, или золотистого стафилококка инфекции 4. Недорогие и эффективные, простые и протоколы для ферментативного переваривания ткани кожи мыши может предоставить препараты клеток, которые могут быть использованы для различных последующих применений, чтобы лучше понять патофизиологию заболеваний кожи. Здесь, простым и экономичным описан способ ферментативного гидролизата кожу мышиткани и выделение кожи лейкоцитов, что проникающих могут быть использованы для культивирования клеток, в естественных приемных передачи, анализа проточной цитометрии и сортировки или исследования экспрессии генов. Общая цель этой процедуры заключается в подготовке единой клеточной суспензии кожи инфильтрирующие лейкоцитов с высокой жизнеспособностью клеток при минимальных затратах, как правило, связанные с наборами реагентов на заказ и механических dissociators.

Существующие методы кожной ткани диссоциации 5-7 может привести к низкой жизнеспособности клеток и поверхностных маркеров целостности, или требовать пользовательские наборы ферментов и дорогие ткани диссоциации машины 8-11. В то время как переваривание мыши уха ткани кожи является достаточно распространенным 12-13, переваривая очень ороговевшей ткани кожи (например, с фланга) может привести к подготовке клеток зараженных с большим количеством неклеточным мусора. В недавнем исследовании, Заид и его коллеги усваивается мыши фланговый кожу в течение 90 мин в 2,5 мг / мл диспаза, Folloво главе с 45 мин в 3 мг / мл коллагеназы 7. В другом исследовании, эти исследователи использовали несколько инкубации с комбинированным переваривания 2,5 ч, в том числе использование трипсина / EDTA, коллагеназы III и диспаза 5. Применение трипсина не рекомендуется для ферментативного расщепления кожи, а лечение с помощью трипсина от разных производителей, как было показано заметно влияет на целостность белков клеточной поверхности на клетках млекопитающих 14-15. Кроме того, диспаза может иметь значительное влияние на пролиферативные способностей CD4 и CD8α Т-клеток и влияет на поверхности изобилие, по крайней мере 20 молекул, в том числе маркеров общего Т активации клеток, таких как CD62L 16. Другие протоколы используют RPMI 1640 в среде пищеварения 6. Тем не менее, наличие Mg 2+ и Ca 2+ в среде RPMI может вызвать агрегацию клеток обширные 17.

Идеальный протокол для ткани диссоциации должны стремиться к высокой жизнеспособности клеток, низкаяУровни агрегации клеток и минимальным повреждением клеточной поверхности белки. Высокое качество подготовки лимфатических узлов стромальных клеток были выполнены с протоколами, которые используют короткие инкубации фермента, Ca 2+ и Mg 2+ свободные средства массовой информации, и избежать трипсина и диспазу 18. Тем не менее, протоколы этого типа не были созданы для диссоциации всей кожи мыши.

Вот протокол описан отделить, изолировать и обогатить кожу проникают лейкоциты-от аллергена оспаривается мыши фланга кожи. Вкратце, вырезали кожу предварительно инкубировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 1 часа, чтобы смягчить ткань для пищеварения и удаления избытка кожи или мертвую жировую ткань. Это сопровождается 30 мин ферментативного расщепления шага с 0,7 мг / мл коллагеназы Д. коллагеназы D имеет минимальное воздействие на плотность маркеров клеточной поверхности и не оказывает влияния на пролиферацию Т-клеток в пробирке 16,18, что делает егохорошо подходит для применений, связанных с характеристику поверхностных белков. После ферментативного расщепления, разрывная центрифугирования в градиенте плотности используют для удаления эпителиальных клеток и мусора от одного суспензии клеток и обогащения кроветворных клеток. Важно отметить, что эта процедура позволяет избежать дорогих колонок на основе реагентов разделения магнитного клеток и тканей диссоциации машины 8-11, и может быть выполнена с оборудованием и материалов, находящихся в основной биомедицинской исследовательской лаборатории. Вот этот протокол был использован для выделения лейкоцитов с фланга кожи оспариваемые три раза гаптена оксазолона (Ox) в ранее сенсибилизированных ND4 швейцарских мышей (взято из 19). Клетки анализировали с помощью многопараметрического проточной цитометрии. Эта методика дала клеточной суспензии с минимальной мусора и> 95% жизнеспособности изолированных лимфоцитов, которые были проанализированы с помощью многопараметрического проточной цитометрии для измерения инфильтрацию Т-лимфоцитов и нейтрофилов в пострадавших SKв.

Protocol

Примечание: 8-12 неделе летняя женщина ND4 Swiss Webster мышей, условно размещены в свободном доступе пищи и воды, были использованы для этих исследований экспериментальный протокол используется (B13S1) был утвержден IACUC Macalester колледжа.. 1. Сенсибилизация и вызов с оксазолоном День 0 <…

Representative Results

Коллагеназа D лечение спленоцитов показывают, что аналогичные уровни CD4 и CD8 альфа на Т-клеток по сравнению с медиа-лечение управления Во-первых, любые потенциальные последствия коллагеназы D от частоты и поверхностной обилие происхожде?…

Discussion

Характеризующий изменение кожных резидентные лейкоцитов в моделях грызунов кожных заболеваний, таких как атопический дерматит и псориаз важно для понимания механистических связей между притоком воспалительных клеток и патологии болезни. Здесь мы опишем экономичный метод, чтобы изо…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Национальные институты здоровья (NIH R15 NS067536-01A1 для постоянного тока), Национальный Вульводиния ассоциация (награда, округ Колумбия), и Macalester колледж поддерживает эту работу. ЦБ получил стипендию от колледжа Макалестер Beckman Ученые программы, финансируемой Арнольд и Мейбл Beckman Foundation. БТФ и ТМ поддерживаются JDRF 2-2011-662. Мы благодарим доктора Джейсона Schenkel и д-р Юлиана Льюис за технической консультацией, и все нынешние и бывшие члены лаборатории Chatterjea за помощь и поддержку.

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

References

  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).

Play Video

Cite This Article
Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

View Video