Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
Affections de la peau allant de la dermatite de contact, l'eczéma, le psoriasis, la cellulite, les infections fongiques et les abcès à des cancers de la peau non-mélanome ont été trouvés à être parmi les 50 maladies les plus répandues dans le monde, et la quatrième cause mondiale des maladies non mortelles en 2010 1. En conséquence, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents pathologies cutanées diverses est une zone nécessaire et actif de la recherche. Des modèles de rongeurs ont été remarquablement utiles pour la compréhension des maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique 2, 3 psoriasis, l'infection ou 4 Staphylococcus aureus. Protocoles peu coûteux, efficaces et simples pour la digestion enzymatique de tissu de la peau de la souris peuvent fournir des préparations de cellules qui peuvent être utilisés pour une variété d'applications en aval afin de mieux comprendre la physiopathologie de maladies de la peau. Ici, une méthode simple et économique est décrit par digestion enzymatique de la peau de souriset l'isolement des tissus cutanés leucocytes infiltrants qui peut être utilisé pour la culture cellulaire, le transfert adoptif in vivo, une analyse par cytométrie de flux et triage ou des études d'expression génique. L'objectif global de cette procédure est de préparer une suspension cellulaire unique de leucocytes infiltrant la peau avec la viabilité cellulaire élevée tout en minimisant les coûts généralement associés à des kits de réactifs personnalisé et dissociateurs mécaniques.
Existants tissu cutané méthodes de dissociation 5-7 peuvent donner lieu à l'intégrité du marqueur bas de la viabilité des cellules et de la surface, ou exiger des kits d'enzymes de mesure et des machines coûteuses de dissociation des tissus 8-11. Alors que la digestion des tissus de la peau de l'oreille de la souris est raisonnablement répandue 12-13, digérant tissu très kératinisée de la peau (par exemple, sur le flanc) peut entraîner des préparations de cellules contaminées avec de grandes quantités de débris non-cellulaire. Dans une étude récente, Zaid et collègues digérés peau du flanc de la souris pendant 90 min dans 2,5 mg / ml dispase, Follomené par 45 min dans 3 mg / ml de collagénase 7. Dans une autre étude, ces chercheurs ont utilisé plusieurs incubations avec une digestion totale de 2,5 h, y compris l'utilisation de trypsine / EDTA, la collagénase III, la dispase et 5. L'utilisation de la trypsine est déconseillé pour la digestion enzymatique de la peau, comme a été montré traitement à la trypsine provenant de différents fabricants pour affecter de manière mesurable l'intégrité des protéines de surface cellulaire sur des cellules de mammifère 14-15. En outre, la dispase peut avoir des effets importants sur la capacité de prolifération des cellules CD4 et CD8a T et affecter l'abondance de surface d'au moins 20 molécules, y compris les marqueurs d'activation des cellules T commun tels que CD62L 16. D'autres protocoles utilisent RPMI 1640 dans le milieu de digestion 6. Cependant, la présence de Mg2 + et Ca2 + dans du RPMI peut provoquer une agrégation de cellules 17 étendue.
Un protocole idéal pour la dissociation des tissus devrait viser pour la viabilité cellulaire élevée, faibleniveaux d'agrégation cellulaire, et un minimum de dommages à la cellule des protéines de surface. Préparations de cellules ganglionnaires du stroma de haute qualité ont été réalisés avec des protocoles qui utilisent plus courtes incubations enzymatiques, Ca 2+ et Mg 2+ médias libres, et d'éviter la trypsine et dispase 18. Cependant, les protocoles de ce type ont pas été établies pour la dissociation de la peau entière de la souris.
Ici, un protocole est décrit à dissocier, isoler, et d'enrichir les leucocytes infiltrant la peau de la peau du flanc de la souris allergène en cause. Brièvement, peau excisée est pré-incubées dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du sérum fœtal bovin de 10% pendant 1 heure pour adoucir le tissu pour la digestion et éliminer tout excès de tissus morts peau ou gras. Ceci est suivi par une étape de digestion enzymatique de 30 min avec 0,7 mg / ml de collagénase D. collagénase D a des effets minimaux sur la densité de marqueurs de surface cellulaire, et aucun effet sur la prolifération des cellules T in vitro 16,18, ce qui rendtrès convenable pour des applications impliquant la caractérisation des protéines de surface. Après digestion enzymatique, discontinue centrifugation en gradient de densité a été utilisé pour éliminer les cellules epitheliales et les débris de la suspension à cellule unique et un enrichissement en cellules hématopoïétiques. Surtout, cette procédure évite des coûteuses cellulaires magnétique réactifs de séparation à base de colonnes et machines de dissociation des tissus 8-11, et peut être réalisé avec l'équipement et de matériaux trouvés dans un laboratoire de recherche biomédicale fondamentale. Ici, ce protocole a été utilisé pour isoler les leucocytes à partir de la peau du flanc contestées trois fois avec de l'oxazolone haptène (Ox) chez des souris suisses précédemment sensibilisées ND4 (adapté à partir de 19). Les cellules ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux multi-paramétrique. Cette technique a donné une suspension de cellules avec un minimum de débris et> 95% de viabilité des lymphocytes isolés qui ont été analysés par écoulement multi-paramétrique cytométrie de mesurer l'infiltration de lymphocytes T et des neutrophiles dans le sk affectéedans.
Protocol
Representative Results
Discussion
La caractérisation des changements dans les leucocytes de la peau résident dans des modèles de rongeurs de maladies de peau telles que la dermatite atopique ou le psoriasis est important pour la compréhension de connexions mécaniques entre les afflux de cellules inflammatoires et la pathologie de la maladie. Nous décrivons ici une technique économique pour isoler des leucocytes à partir du tissu de la peau avec l'équipement de base dans la plupart des laboratoires de recherche biomédicale. Cette technique …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 à DC), l'Association nationale Vulvodynia (prix à DC), et Macalester College soutenu ce travail. CB a reçu une bourse du Programme de Beckman Scholars Macalester College, financé par la Fondation Arnold et Mabel Beckman. BTF et TM sont pris en charge par la FRDJ 2-2011-662. Nous remercions le Dr Jason Schenkel et le Dr Juliana Lewis pour obtenir des conseils techniques, et tous les membres actuels et anciens du laboratoire Chatterjea pour leur aide et leur soutien.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
