Summary

Данио рерио в качестве модели для оценки тератогенных потенциал Нитрит

Published: February 16, 2016
doi:

Summary

Воздействие тератогенами может вызвать врожденные дефекты. Рерио являются полезными для определения тератогенного потенциала химических веществ. Мы показали полезность данио, подвергая эмбрионов различных уровнях нитрита, а также в разное время экспозиции. Покажем, что нитрит может быть токсичным и вызвать серьезные пороки развития.

Abstract

Высокие уровни нитрата в окружающей среде могут привести к врожденных дефектов или выкидыша у человека. Предположительно, это связано с конверсии нитрата в нитрит кишечной и слюнных бактерий. Тем не менее, в других исследованиях млекопитающих, высокий уровень нитритов не вызвать врожденные дефекты, хотя они могут привести к ухудшению репродуктивной. Таким образом, тератогенный потенциал нитрита не ясно. Было бы полезно иметь позвоночных модельную систему легко оценить тератогенное действие нитрита или любого другого химиката, представляющего интерес. Здесь мы продемонстрировать полезность данио (Danio rerio) для скрининга соединений на токсичность и эмбриональных дефектов. Эмбрионы рыбок данио оплодотворены внешне и имеют быстрое развитие, что делает их хорошей моделью для тератогенных исследований. Покажем, что увеличение времени экспозиции до нитрита отрицательно сказывается на выживаемости. Повышение концентрации нитрита также отрицательно сказывается на выживаемости, в то время как нитрат нет. Для эмбрионов тхат выжить нитрита экспозицию, различные дефекты могут возникать, в том числе перикард и желточного мешка отек, плавать noninflation мочевого пузыря, и черепно-лицевых пороков. Наши результаты показывают, что данио является удобной системой для изучения тератогенного потенциала нитрита. Этот подход может быть легко адаптирована для тестирования других химических веществ для их воздействия на ранней позвоночных развития.

Introduction

Тератогенеза это процесс, который разрушает нормальное развитие эмбриона или плода, вызывая постоянные структурные и функциональные аномалии, задержку роста, или выкидыш в тяжелых случаях 1. Это может быть вызвано определенных природных веществ (тератогенами), которые препятствуют эмбрионального развития несколькими способами 2. В период внутриутробного развития человека, общая тератогены таких как радиация, инфекционные агенты, токсичные металлы и органических химических веществ, как сообщалось, вызывают дефекты в epicanthic складок (кожной складки в верхней крышке глаза) и клинодактилия (изогнутый палец или) через морфогенетических ошибок 1.

Понимание молекулярного механизма тератогенеза является первым шагом на пути к разработке лечения и профилактики. Несколько позвоночных модели, такие как Африканский когтистые лягушки (Xenopus Laevis) и данио (Danio rerio) были использованы для определения молекулярных путей, пострадавших от teratogens. Предыдущие исследования использовали данио в качестве модели для эпидемиологии, токсикологии и тератогенеза 3-7. Scholz и др. считается данио как «золотой стандарт» для оценки воздействия на окружающую токсичности. Это связано, в частности, к прозрачности данио эмбриона, что позволяет исследователям визуализировать дефект с развитием, как это происходит 8. Примерно 70% человеческих генов имеют ортологи у рыбок данио, делая данио желаемый модель позвоночных для изучения человеческие пороки 9.

Некоторые эпидемиологические исследования показали, что нитраты и нитриты, обычно присутствующие в сельскохозяйственных продуктах и воде, которые связаны с врожденными дефектами или самопроизвольных абортов 10,11, в то время как другие исследования не поддерживают эту ассоциацию 12. Нитраты (NO 3 -) и нитрит (NO 2 -) естественным образом присутствуют в почве и воде. Они являются источником азота для растений и являются частью пitrogen цикл 13. Такие продукты, как зеленые бобы, морковь, кабачки, шпинат, и свеклы из хозяйств, которые используют удобрения с высоким содержанием нитратов значительно увеличены уровни нитратов и нитритов 7. Молоко от коров, которых кормили продуктов с высоким содержанием нитратов и рыб в высокой нитрата воды (в основном из стока почвы 30) может привести к людям, потребляющих большое количество нитратов и нитритов 14. Нитраты и нитриты, также широко используется при консервировании пищи, что резко увеличивает количество попадает в организм человека 12.

Оптимальные уровни нитратов и нитритов играть фундаментальную роль в физиологических процессах, таких как сосудистой гомеостаза и функции, нейротрансмиссии и иммунологических механизмов защиты хозяина 13-15. Тем не менее, воздействие высоких уровней нитратов и нитритов может привести к неблагоприятным последствиям, особенно у младенцев и детей 16. Заглатывании нитрат далее превращают в нитрит в ротовой полости микрофлорой и в гое желудочно-кишечного тракта кишечной микрофлоры 17.

Нитрат ставит младенцев в высоком риске развития синдрома синего младенца путем окисления гемоглобина в метгемоглобин, ухудшая гемоглобин из его переносить кислород способность 18. Это приводит к синему цвету кожи, который простирается до периферических тканях в более тяжелых случаях. Ингибированная оксигенации тканей приводит к другим симптомам, наиболее сильно приводит к коме и смерти 19,20. Подобные симптомы наблюдаются у младенцев и взрослых при более высоких концентрациях нитрата 21. Повышенные уровни метгемоглобина у взрослых из-за нитрита отравление приводит к цианоз, головная боль, расстройства дыхания 31 и смерть, если не лечить из-за осложнений, связанных с жизненно тканевой гипоксии 32,33.

Нитрат попадает на более высоких уровнях также может привести к различным осложнениям. детского диабета, рецидивирующий понос, и рецидивирующие инфекции дыхательных путейу детей были связаны с высокой нитрата впускного 11,17,22. Хроническое воздействие на высокий уровень нитрата связано с мочеиспусканием и селезенки кровоизлияния. Острое воздействие высоких доз нитратов с может привести к широкому спектру заболеваний, как боль в животе, мышечной слабости, крови в стуле и моче, обмороки и смерти 11. Пренатальное воздействие нитрата при высоких уровнях была связана с нервной трубки и опорно-двигательного дефекта 11.

Недавний отчет показал, что лечение эмбрионов данио с нитритом привело к желточного мешка отек, черепно-лицевых и осевые пороки, и плавать noninflation мочевого пузыря 5. В данном исследовании мы демонстрируем способ лечения эмбрионов данио с нитратов и нитритов, чтобы определить их тератогенным потенциалом. Эмбрионы подвергали воздействию нитрита при различных концентрациях и различных промежутков времени. Этанол использовали в качестве положительного контроля, поскольку она является установленным тератогенным 23. Оур метод показал, что оба высокие концентрации и длительное время экспозиции до нитрита были вредны для выживания и повлекли за собой различные фенотипы, начиная от легкой (отек) и тяжелых (брутто пороков развития). Таким образом, данио является полезной моделью для непосредственного изучения потенциальных тератогенных эффектов нитратов и нитритов на эмбрионах дополнить эпидемиологические исследования.

Protocol

Процедуры, описанные в данном протоколе были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных от университета Индианы Пенсильвании. 1. Урожай Эмбрионы Поддержание данио на 28,5 ° С, рН 7, проводимость между 500-1500 мкСм и цикл свет / темнота 14 ч света и …

Representative Results

Воздействие до 300 мм этанола в течение 22 ч не влияло на выживаемость (данные не показаны), что согласуется с предыдущими сообщениями 5,23,26. Ожидается, что это, как этанол является известным тератогенным и служил в качестве положительного контроля. Наблюдаемые фено?…

Discussion

Метод, описанный здесь демонстрирует полезность данио в оценке тератогенного потенциала нитритов и нитратов. По сравнению с другими позвоночных, данио имеют свои преимущества, которые включают высокую плодовитость, наружное оплодотворение, оптическую прозрачность, и быстрое развити…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.

Materials

DREL/2010 instrument Hach 26700-03
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
KIMAX glass Petri Dish VWR 89001-244
MS-222 Sigma-Aldrich E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent Hach 14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent Hach 14065-99
Parafilm Fisher Scientific 3-374-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
S6E stereomicroscope Leica 10446294
Sodium nitrate Fisher Scientific S343
Sodium nitrite Fisher Scientific S347
Transfer pipets Laboratory Products Sales L320072
Glass vials Fisher Scientific 03-338B

References

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
  3. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
  4. Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
  5. Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
  6. Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
  7. Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
  8. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  9. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  10. CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water–LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
  11. Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
  12. Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
  13. Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
  14. Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
  15. Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
  16. Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
  17. Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
  18. Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
  19. Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
  20. Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
  21. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
  22. Westerfield, M. . The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
  24. Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
  25. Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
  26. . . Methods for chemical analysis of water and wastes. , (1983).
  27. Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
  28. Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , 1-26 (1996).
  29. Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
  30. Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
  31. Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
  32. Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  33. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  34. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  35. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).

Play Video

Cite This Article
Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A. E., Simmons, T. W., Diep, C. Q. Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite. J. Vis. Exp. (108), e53615, doi:10.3791/53615 (2016).

View Video