Summary

Zebrafisch als Modell zur Bewertung der teratogene Potenzial von Nitrit

Published: February 16, 2016
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Summary

Die Exposition gegenüber Teratogenen kann Geburtsfehler verursachen. Zebrafische sind nützlich für das teratogene Potential von Chemikalien zu bestimmen. Wir zeigen die Nützlichkeit von Zebrafisch-Embryonen durch zu verschiedenen Ebenen von Nitrit und auch zu verschiedenen Zeiten der Belichtung ausgesetzt wird. Wir zeigen, dass Nitrit giftig sein können und schwere Entwicklungsstörungen verursachen.

Abstract

Hohe Nitratwerte in der Umgebung können in angeborenen Defekten oder Fehlgeburten bei Menschen führen. Vermutlich ist dies auf die Umwandlung von Nitrat zu Nitrit von Darm und Speichelbakterien. Aber auch in anderen Säugetier-Studien, hohe Nitritwerte nicht Geburtsfehler verursachen, obwohl sie zu einer schlechten reproduktiven Ergebnissen führen kann. Somit ist das teratogene Potential von Nitrit nicht klar. Es wäre sinnvoll, ein Wirbeltier-Modellsystem zu haben, um leicht fruchtschädigende Wirkung von Nitrit oder ähnliche chemische meisten interessieren. Hier zeigen wir die Nützlichkeit von Zebrafisch (Danio rerio) Verbindungen zur Toxizität und embryonalen Mängel zu untersuchen. Zebrafisch-Embryonen werden extern befruchtet und haben die rasante Entwicklung, ihnen ein gutes Modell für teratogene Studien zu machen. Wir zeigen, dass die Zeit der Belichtung zu erhöhen negativ Überleben beeinflusst zu Nitrit. die Konzentration von Nitrit Erhöhung wirkt sich auch negativ auf das Überleben, während Nitrat nicht. Für Embryonen that überleben Nitrit Belichtung können verschiedene Defekte auftreten, einschließlich Herzbeutel und Dottersack Ödeme, Schwimmblase noninflation sowie Schädel- und Gesichtsfehlbildung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Zebrafisch ein bequemes System ist das teratogene Potential von Nitrit zu studieren. Dieser Ansatz kann leicht für ihre Auswirkungen auf die frühe Entwicklung von Wirbeltieren zu testen, andere Chemikalien angepasst werden.

Introduction

Teratogenese ist ein Prozess, der die normale Entwicklung des Embryos oder Fötus 1 durch was zu dauerhaften strukturellen und funktionellen Störungen, Wachstumsverzögerung oder Fehlgeburt in schweren Fällen stört. Es kann durch bestimmte natürliche Substanzen (teratogen) hervorgerufen werden, die zwei in mehrfacher Hinsicht mit der embryonalen Entwicklung stören. Während menschliche fetale Entwicklung, gemeinsame Teratogenen wie Strahlung, Infektionserreger, toxische Metalle und organische Chemikalien berichtet Mängel in Epikanthus (die Hautfalte im oberen Augenlid) und Klinodaktylie (gekrümmte Finger oder Zehen) durch morphogenetische Fehler zu verursachen 1.

den molekularen Mechanismus der teratogenesis zu verstehen, ist der erste Schritt zur Behandlung und Prävention zu entwickeln. Mehrere Wirbeltiermodellen wie dem afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) und Zebrafisch (Danio rerio) verwendet worden, um die molekularen Signalwege betroffen zu bestimmen, indem teratOgens. Frühere Studien haben für Epidemiologie, Toxikologie und teratogenesis 7.3 Zebrafisch als Modell verwendet. Scholz et al. betrachtet Zebrafisch als "Goldstandard" für Umwelttoxizität Beurteilung. Dies ist darauf zurückzuführen, zum Teil auf die Transparenz des Zebrafischembryo, die Forscher können die Entwicklungsdefekt sichtbar zu machen, wie es 8 auftritt. Etwa 70% der menschlichen Gene haben Orthologe im Zebrafisch, Zebrafisch macht eine wünschenswerte Wirbeltiermodell für die Untersuchung menschlicher Mängel 9.

Einige epidemiologische Studien haben vorgeschlagen, dass Nitrat und Nitrit, üblicherweise in landwirtschaftlichen Lebensmitteln und Wasser, sind im Zusammenhang mit Geburtsschäden oder Fehlgeburten 10,11, während andere Studien nicht unterstützen diese Verbindung 12. Nitrat (NO 3 -) und Nitrit (NO 2 -) sind von Natur aus in Boden und Wasser. Sie sind eine Stickstoffquelle für Pflanzen und sind ein Teil der nitrogen Zyklus 13. Lebensmittel wie grüne Bohnen, Karotten, Kürbis, Spinat und Rüben aus Betrieben, die Düngemittel reich an Nitrat verwenden haben Gehalte für Nitrat und Nitrit 7 deutlich erweitert. Milch von Kühen mit hohen Nitrat Lebensmitteln und Fisch in hohen Nitrat Wasser (vor allem aus dem Boden Abfluss 30) zugeführt wird auf den Menschen führen große Mengen an Nitrat und Nitrit raub 14. Nitrat und Nitrit sind auch häufig in der Lebensmittelkonservierung verwendet, die drastisch die Menge von Menschen eingenommen 12 erhöht.

Die optimale Einsatzmenge von Nitrat und Nitrit spielen fundamentale Rolle bei physiologischen Prozessen wie vaskuläre Homöostase und Funktion, Neurotransmission und immunologische Abwehrmechanismen des Wirts 13-15. Allerdings Exposition gegenüber hohen Nitrat und Nitrit kann zu Nebenwirkungen führen, vor allem bei Säuglingen und Kindern 16. Ingested Nitrat ist weiter umgewandelt zu Nitrit in der Mundhöhle von der Mikroflora und in the Gastrointestinaltrakt durch Darmflora 17.

Nitrat setzt Kleinkinder auf einem hohen Risiko für blaues Baby-Syndrom durch Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin, Hämoglobin von seinem Sauerstoff beeinträchtigt Tragfähigkeit 18. Daraus ergibt sich die blaue Farbe der Haut, die in schweren Fällen zu peripheren Geweben erstreckt. Gehemmt Sauerstoffversorgung der Gewebe führt zu anderen Symptomen, was am schwersten zu Koma und Tod 19,20. Ähnliche Symptome sind bei Säuglingen und Erwachsenen bei höheren Konzentrationen an Nitrat 21 beobachtet. Erhöhte Konzentrationen von Methämoglobin bei Erwachsenen aufgrund Nitritvergiftung führt zu Zyanose, Kopfschmerzen, Atemstörungen 31 und Tod, wenn nicht aufgrund von Komplikationen behandelt im Zusammenhang mit lebenswichtigen Gewebshypoxie 32,33.

Nitrat auf höheren Ebenen eingenommen kann auch zu verschiedenen gesundheitlichen Komplikationen. Diabetes bei Kindern, wiederkehrender Durchfall, und wiederkehrenden Infektionen der Atemwegebei Kindern wurden mit hohen Nitrataufnahme 11,17,22 verbunden. Die chronische Exposition zu einem hohen Niveau von Nitrat wird beim Wasserlassen und Milz Blutungen verbunden. Akute Hochdosis-Exposition gegenüber Nitrat kann im Stuhl und Urin, Ohnmacht und Tod 11 auf ein breites Spektrum von Erkrankungen wie Bauchschmerzen, Muskelschwäche, Blut führen. Pränatalen Exposition gegenüber Nitrat auf hohem Niveau hat mit Neuralrohr und Muskel-Skelett-Defekt 11 in Verbindung gebracht.

Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass Zebrafischembryonen mit Nitrit Behandlung führte sac Ödeme, Gesichtsschädel und axiale Fehlbildungen zu Eigelb und Schwimmblase noninflation 5. In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Behandlung Zebrafischembryonen mit Nitrat und Nitrit ihre teratogene Potential zu bestimmen. Die Embryonen wurden bei verschiedenen Konzentrationen und unterschiedlich lange ausgesetzt zu Nitrit. Ethanol wurde als positive Kontrolle verwendet, da es eine etablierte teratogen 23 ist. Our Verfahren zeigten, dass sowohl hohe Konzentrationen und langen Belichtungszeiten zu Nitrit zu Überleben und führte zu verschiedenen Phänotypen, die von mild (Ödem) zu schweren (brutto Entwicklungsdefekten) schädlich waren. Daher ist der Zebrafisch ein nützliches Modell für direkt die möglichen teratogene Wirkungen von Nitrat und Nitrit an Embryonen zu erkunden epidemiologischen Studien zu ergänzen.

Protocol

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Indiana University of Pennsylvania genehmigt. 1. Ernte Embryonen Pflegen Zebrafisch bei 28,5 ° C, pH 7, Leitfähigkeit zwischen 500-1.500 uS, und ein Hell / Dunkel-Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit 24. Verwenden Wildtyp-Stämme, wie Di, AB oder TU / AB-Hybrid. Verschiedene Stämme können unterschiedlich auf chemische Behandlung 25</s…

Representative Results

Die Exposition gegenüber 300 mM Ethanol für 22 h hatte keinen Effekt auf das Überleben (Daten nicht gezeigt) mit früheren Berichten konsistent 5,23,26. Dies wird erwartet, da Ethanol eine bekannte teratogen ist und diente als Positivkontrolle. Die beobachteten Phänotypen enthalten pericardial Ödeme, Schwimmblase noninflation (Abbildung 1), Schädeldefekten und Entwicklungsverzögerung (Daten nicht gezeigt). <p class="jove_content" fo:keep-together.wi…

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Nützlichkeit von Zebrafisch in das teratogene Potential von Nitrit und Nitrat zu beurteilen. Im Vergleich zu anderen Wirbeltieren, Zebrafisch Vorteile haben, die hohe Fruchtbarkeit sind, externe Düngung, optische Transparenz und schnelle Entwicklung. Erhältlich Mutanten, die helfen Pigmentierung (wie die Casper Zebrafisch-36) auch fehlen, um die Sichtbarkeit der inneren Organe zu verbessern. Es ist auch einfach transgene Zebrafisch mit Reportergenen zu erzeugen Ana…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.

Materials

DREL/2010 instrument Hach 26700-03
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
KIMAX glass Petri Dish VWR 89001-244
MS-222 Sigma-Aldrich E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent Hach 14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent Hach 14065-99
Parafilm Fisher Scientific 3-374-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
S6E stereomicroscope Leica 10446294
Sodium nitrate Fisher Scientific S343
Sodium nitrite Fisher Scientific S347
Transfer pipets Laboratory Products Sales L320072
Glass vials Fisher Scientific 03-338B

References

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
  3. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
  4. Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
  5. Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
  6. Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
  7. Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
  8. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  9. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  10. CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water–LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
  11. Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
  12. Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
  13. Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
  14. Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
  15. Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
  16. Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
  17. Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
  18. Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
  19. Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
  20. Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
  21. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
  22. Westerfield, M. . The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
  24. Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
  25. Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
  26. . . Methods for chemical analysis of water and wastes. , (1983).
  27. Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
  28. Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , 1-26 (1996).
  29. Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
  30. Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
  31. Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
  32. Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  33. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  34. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  35. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).

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Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A. E., Simmons, T. W., Diep, C. Q. Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite. J. Vis. Exp. (108), e53615, doi:10.3791/53615 (2016).

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