This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.
El objetivo general fue desarrollar un método para la siembra de células, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos en el biosensor ECIS. El objetivo para el desarrollo de este biosensor era para satisfacer las especificaciones del Ejército de EE.UU. para un dispositivo portátil de campo que podría detectar la posible contaminación de los suministros de agua potable que se utiliza por los soldados. Los requisitos para el sensor de toxicidad fueron que podría detectar un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos rápidamente (dentro de una hora) a concentraciones relevantes para la salud humana, que el dispositivo sea de campo portátil, y los componentes biológicos tendría una vida útil de al menos nueve meses. Refrigeración, pero no helada, de los componentes perecederos era aceptable.
Históricamente, las tecnologías de campo portátiles de análisis de agua con un componente biológico para ellos (tales como anticuerpos, enzimas o ácidos nucleicos) han sido específico del analito 1-3. La desventaja de estos tipos de biosensores es que van a ONLy detectar un tipo de producto químico a la vez. Se necesitan sensores múltiples si se sospecha de que más de un producto químico está presente. Si un sensor específico no está en el repertorio de evaluación, los contaminantes químicos en el agua podrían fácilmente no se detectan.
sensores de toxicidad de base amplia, por el contrario, tienen el potencial para llenar esta brecha tecnológica. Estos por lo general tienen un componente celular a ellos 4-8. Las ventajas de los biosensores de toxicidad son de amplia base que pueden detectar la presencia de una amplia variedad de contaminantes químicos, incluidas las mezclas y las incógnitas, en un período relativamente corto de tiempo 5,9,10.
El concepto de usar la medición de la impedancia eléctrica de monocapas de células como una posible toxicidad sensor, que también se conoce como eléctrico de pila de sustrato de impedancia de detección (IEM), fue descrito por primera vez por Giaever y Keese 11. Durante las últimas dos décadas se ha demostrado que es un indicador sensible de VIAB célulaility y la citotoxicidad. Básicamente, la monocapa de células que se adhiere a los electrodos en los biochips se expone a alta frecuencia y baja tensión y la señal de corriente alterna amperaje. La monocapa confluente de células impide el flujo de electrones. Cuando se ve comprometida la integridad de la monocapa celular (como cuando se introduce una sustancia química tóxica), el sensor ECIS registra un cambio en la impedancia eléctrica 11-14. La figura 1 ilustra el principio de ECIS en relación con la monocapa de células en el biochip .
Figura 1:.. Principio de ECIS Ilustración de una monocapa de células en un biochip con lector de ECIS simplificado esquema eléctrico Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los métodos para la siembra, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos que contienenmonocapas de células RTgill-W1 en biochips de fluidos en un biosensor ECIS se describen aquí. Los biochips de fluidos se pueden almacenar durante un máximo de 9 meses en un estado refrigerado y pueden ser enviados en un contenedor de almacenamiento en frío, para la prueba de supplies.The de agua potable que acompañan a los lectores ECIS, o unidades de prueba, se envían por separado. Los biochips tienen dos componentes a ellos; una capa de policarbonato superior con dos canales de fluido separados, y una capa inferior electrónica que contiene cuatro electrodos por canal para detección de impedancia. Hay 10 electrodos de trabajo por la almohadilla; cada electrodo es de 250 micras de diámetro. Los biochips reunidos tienen conexiones de electrodo de oro para adquirir lecturas de impedancia cuando se inserta en la unidad de prueba ECIS. Cada uno de los dos canales en forma de U de fluidos cerrados llevará a cabo 2 ml de la suspensión celular RTgill-W1. La figura 2 muestra un biochip fluídico en el lector ECIS con una ampliación de una células confluentes en un único electrodo de detección.
<p class= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">La tecnología ECIS tuvo un buen desempeño en un entorno de laboratorio y fue capaz de detectar posibles contaminantes del agua en concentraciones que son relevantes para la salud humana. La portabilidad y el embalaje de la tecnología hace que sea propicio para el uso en el campo.
Los pasos críticos en el protocolo para el éxito de la tecnología son los siguientes: 1) Mantener condiciones asépticas durante el cultivo, la siembra, y la alimentación de los biochips, 2) Mantener los biochips sembradas en condiciones refrigeradas hasta que esté listo para la prueba ya que las células RTgill-W1 no sobrevivir mucho tiempo una vez que se someten a temperaturas por encima de 25 ° C, 3) pesar con precisión la L-15ex en los viales de los medios en polvo y medir con precisión las muestras de agua para evitar la producción de falsos positivos, que pueden ser causados por un cambio en la osmolalidad de los medios de comunicación en lugar de la toxicidad de la muestra, 4) Siga las instrucciones del usuario en la pantalla ECIS para ejecutar las pruebas. El software en el lector alertará al usuario si un biochip es inaceptable para las pruebas (en base a las lecturas iniciales de impedancia) cuando el biochip se inserta primero en el lector. Si los niveles de impedancia son inaceptables para la prueba, el software no permitirá que el usuario para proceder con la prueba hasta que se utiliza un nuevo biochip. Las razones para las lecturas de impedancia inaceptables son por lo general debido a una ligera falta de alineación de los electrodos biochip con los pasadores lector ECIS o fugas de fluido a lo largo de uno de los bordes de encolado del biochip.
Hay algunos límites a esta tecnología debido a que el sensor de ECIS sólo se ha probado con agua potable y no con las aguas superficiales. Las células RTgill-W1 que se encuentran en el biochip no pueden tolerar la congelación o las temperaturas muy por encima de 25 ° C durante períodos prolongados de tiempo (período de tiempo puede ser de horas o días dependiendo de la temperatura. Los biochips funcionan mejor en un rango de temperatura de refrigeración de 7 temperatura ambiente. Ellos están listos para su uso inmediato, sin embargo, justo después de haber sido removed de una cámara frigorífica. contenedores portátiles de almacenamiento en frío son utilizados actualmente por personal del Ejército en el campo de los suministros sensibles a la temperatura. Estos mismos contenedores se pueden utilizar para el transporte biochip cabeza de serie.
Otro límite para esta tecnología es que a pesar de que es un sensor de toxicidad de banda ancha, no responden bien, en todo caso, a los compuestos inhibidores de la colinesterasa, tales como algunos pesticidas. Para llenar este vacío capacidad, el sensor ECIS está diseñado para ser utilizado conjuntamente con un ensayo de prueba rápida de pesticidas disponibles en el comercio cuando el análisis de muestras de agua con el fin de proporcionar al usuario una gama más amplia de pruebas de toxicidad. El kit es un ensayo enzimático rápido diseñado para detectar pesticidas organofosforados y carbamatos dentro de 30 min.
El sensor de ECIS complementa el wqas-PM (Sistema de Análisis de la Calidad del Agua – Medicina Preventiva) Sistema de prueba de agua en el campo, utilizado actualmente por personal de medicina preventiva para detectar militares, Arsenic, plomo, o cianuro en una muestra de agua potable. Aunque el sensor ECIS no va a identificar lo que es el contaminante, se indicará si ciertos metales o compuestos orgánicos están presentes, lo que indica que el agua puede no ser adecuado para el consumo humano. Los resultados de la prueba ECIS están disponibles dentro de una hora. Las muestras de agua a continuación, pueden ser enviados para su posterior análisis para la identificación del contaminante, si se obtiene un resultado positivo de la prueba.
Como se describió anteriormente, el lector ECIS está diseñado para ser parte de un sistema que incluye un kit de ACE enzimática separado con el fin de cubrir un amplio espectro de detección de contaminantes. Ambos de estos lectores están siendo empaquetados en una caja resistente para transporte de campo para uso en campo por los soldados.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.
Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips. |
PBS, w/o Ca++ or Mg++ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
70 % ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
20 mL syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
1 gram silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C. | |
Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells. |
Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip. |
Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip. |
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing. |
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C. |