This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.
전반적인 목표는 ECIS 바이오 센서의 셀 시드, 유체 저장 및 바이오칩의 테스트 방법을 개발 하였다. 이 바이오 센서의 개발 목표는 군인에 의해 사용되는 식수 공급의 오염 가능성을 감지 할 수있는 필드 휴대용 장치에 대한 미 육군 사양을 충족하는 것이 었습니다. 독성 센서 요구 장치가 전계 휴대용 것이 그것이 인간의 건강에 중요한 농도 (시간 이내)이 급속히 독성 산업 화합물의 넓은 스펙트럼을 검출 할 수 및 생물학적 성분의 저장 수명을 가질 것으로했다 적어도 구개월. 부패하기 쉬운 구성 요소가 허용되었다 냉동,하지만, 냉동 없습니다.
역사적으로, (항체, 효소, 또는 핵산 등) 그들에게 생물학적 구성 요소 필드 휴대용 물 테스트 기술은 분석 고유의 1-3이었다. 바이오 센서의 이러한 유형의 단점은 ONL 것입니다Y는 한번에 한 종류의 화학 물질을 검출한다. 이는 하나 이상의 화학 물질이 존재하는 것으로 의심되는 경우에는 다수의 센서가 필요하다. 특정 센서 테스트 레퍼토리에없는 경우 물, 화학적 오염 물질은 쉽게 발견되지 않을 수있다.
광범위한 독성 센서, 다른 한편으로는, 이러한 기술의 갭을 채울 수있는 잠재력을 가지고있다. 이들은 일반적으로 그들 4-8로 휴대 구성 요소가 있습니다. 광범위한 독성 바이오 센서의 장점은 시간 5,9,10 비교적 짧은 기간에서의 혼합물과 미지수를 포함한 화학적 오염 물질의 다양한 배열의 존재를 감지 할 수있다.
또한 전지 셀 기판 임피던스 센서 (ECIS)로 알려져 가능한 독성 센서와 같은 세포 단층의 온 저항의 측정을 사용하는 개념은 제 Giaever 및 Keese 11에 의해 설명되었다. 지난 20 년 동안이 세포 viab의 중요한 지표가 될 것으로 나타났다ility 및 세포 독성. 기본적으로, 바이오칩에 전극에 부착 된 세포 단층 고주파 낮은 전압 및 전류량 교류 신호에 노출된다. 세포의 융합 단층은 전자의 흐름을 방해한다. 세포 단층의 무결성 (예 : 독성 화학 물질이 도입되는 경우와 같이)이 손상되면 ECIS 센서는 전기 임피던스의 변화를 기록 11-14.도 1은 바이오칩에 세포 단층 관련 ECIS의 원리를 도시 .
그림 1 :.. 단순화 ECIS 리더 전기 회로도와 바이오칩에 세포 단층의 ECIS 그림의 원칙 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시드, 저장 및 포함 된 유체 바이오칩의 테스트를위한 방법ECIS 바이오 센서의 유체 바이오칩에 RTgill-W1 세포의 단층 여기에 설명되어 있습니다. 유체 바이오칩은 냉장 상태에서 최대 9 개월 동안 저장 될 수 있으며, 별도로 배송되며, 식수 supplies.The 동반 ECIS 리더, 테스트 단위 테스트, 냉장 컨테이너에 선적 할 수있다. 바이오칩은 그들에게 두 가지 구성 요소가있다; 두 개의 유체 채널 및 임피던스 검출 용 채널당 네 개의 전극 패드를 포함한 전자 하부 층 상부의 폴리 카보네이트 층을 포함한다. 패드 당 10 작동 전극이있다; 각 전극은 직경 250 μm의입니다. 조립 된 바이오칩은 ECIS 테스트 장치에 삽입 할 때 임피던스 측정을 취득 금 전극 연결이 있습니다. 두 개의 밀폐 된 유체 U 자형 채널 각각. RTgill-W1 세포 현탁액 2 ㎖를 보유이 단일 감지 전극에 합류 셀 배율 ECIS 판독기 유체 바이오칩을 보여준다 할 것이다.
<p class= FO "jove_content"유지 – together.within 페이지를 = "1">ECIS 기술로 실험실 환경에서 잘 수행 인체에 적합하다 농도 전위 물 오염 물질을 검출 할 수 있었다. 기술의 이동성 및 포장 필드를 사용하는 것이 도움이 있습니다.
1) 문화, 파종하는 동안 무균 상태를 유지하고, 바이오칩의 공급, 2) RTgill-W1 세포부터 테스트를위한 준비가 될 때까지 냉장 조건에서 시드 바이오칩을 계속 다음과 같이 기술의 성공을위한 프로토콜의 중요한 단계는 매우 긴 그들이 25 ° C 이상의 온도에 노출되면 살아남지 못할 것이다, 3) 정확하게 분말 미디어 유리 병에 L-15ex의 무게를 정확하게의 변화에 의해 발생할 수 있습니다 오탐 (false positive)을 생산 방지하기 위해 물 샘플을 측정 미디어가 아닌 샘플 독성의 삼투압은, 4) 테스트를 실행하기위한 ECIS 화면에 사용자의 지시 사항을 따르십시오. 독자의 소프트웨어는 양방향이 경우 사용자에게 경고합니다바이오칩은 먼저 판독기에 삽입 될 때 ochip은 (초기 임피던스 측정 기준) 테스트를위한 받아 들일 수없는 것입니다. 임피던스 레벨 테스트에 대한 수용 할 수없는 경우, 소프트웨어는 새로운 바이오 칩이 사용될 때까지 사용자가 검사를 진행하는 것을 허용하지 않을 것이다. 용인 임피던스 측정 이유 때문에 ECIS 리더 핀 또는 바이오칩의 접착 에지 중 하나를 따라 유체 누출로 바이오칩 전극 약간 오정렬 보통이다.
ECIS 센서 만 마시는 물 테스트하지 표면의 물 되었기 때문에이 기술에 약간의 제한이 있습니다. 바이오 칩에있는 RTgill-W1 세포 (기간은 온도에 따라 일 시간에서 할 수있는 시간의 연장 기간 동안 많은 25 ° C 이상 동결 또는 온도를 견딜 수 없습니다. 바이오칩은 온도 범위에서 최선을 기능에 냉장에서 실온 7. 그들은 바로 연구 된 후, 그러나, 즉시 사용할 준비가냉장에서 emoved. 휴대용 냉장 컨테이너는 현재 온도에 민감한 소모품 분야에서 육군 요원에 의해 사용됩니다. 이 같은 용기 시드 바이오칩 전송을 위해 사용될 수있다.
이 기술에 대한 다른 제한은 광대역 독성 센서 비록 모든 경우는 일부 살충제로서 콜린 에스 테라 제 – 억제 화합물에 잘 응답하지 않는다는 것이다. 이러한 성능 갭을 채우기 위해, ECIS 센서 독성 시험의 넓은 범위를 사용자에게 제공하기 위해 물 샘플 테스트시 시판 신속한 농약 시험 분석과 함께 사용하도록 설계된다. 키트는 30 분 내에 유기 인계와 카바 메이트 살충제를 검출하기위한 신속 효소 분석법이다.
현재 검색 군사 예방 의학 담당자가 사용하는 필드 물 테스트 시스템, 아르센 – ECIS 센서는 WQAS-PM (예방 의학 수질 분석 시스템)를 보완식수 샘플 IC에서, 납, 또는 시안화. ECIS 센서는 오염물이 무엇인지 식별하지는 않지만 특정 금속 또는 유기 화합물이 존재하는 경우, 물이 인간 소비에 적합하지 않을 수 있음을 나타내는 표시된다. ECIS 테스트 결과는 시간 내에 사용할 수 있습니다. 양성 결과가 있으면 물 샘플이어서 오염물의 식별을 추가 분석을 위해 송출된다.
전술 한 바와 같이, ECIS 판독기 오염물 검출의 광범위한 스펙트럼을 커버하기 위해 별도 효소 ACE 키트를 포함하는 시스템의 일부가 될 수 있도록 설계된다. 이 독자는 모두 군인에 의해 필드에 사용할 필드 전송을위한 튼튼한 케이스에 포장되고있다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.
Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips. |
PBS, w/o Ca++ or Mg++ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
70 % ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
20 mL syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
1 gram silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C. | |
Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells. |
Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip. |
Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip. |
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing. |
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C. |