Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomes kleine blaasjes variërend in grootte van 30 nm tot 100 nm dat zowel constitutief en na stimulering vrijkomen uit verschillende celtypen. Ze worden gevonden in een aantal biologische vloeistoffen en staan bekend om een verscheidenheid van eiwitten, lipiden en nucleïnezuurmoleculen dragen. Aanvankelijk gedacht dat iets meer dan reservoirs voor cellulaire resten, worden de rollen van exosomes reguleren van biologische processen en ziekten steeds gewaardeerd.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren exosomes van cellulaire cultuurmedia en biologische vloeistoffen. Door hun kleine omvang en lage dichtheid, differentieel ultracentrifugatie en / of ultrafiltratie zijn de meest gebruikte technieken om exosome isolatie. Echter, plasma van HIV-1 geïnfecteerde individuen bevat zowel exosomes en HIV virusdeeltjes, die van vergelijkbare grootte en dichtheid. Aldus efficiënte scheiding van exosomen uit HIV virale deeltjes in menselijk plasma iseen uitdaging.
Om deze beperking te pakken we een gemodificeerde procedure van Cantin et ontwikkeld. al., 2008 voor de zuivering van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma. Iodixanol snelheidsgradiënten gebruikt om exosomes scheiden van HIV-1 deeltjes in het plasma van HIV-1 positieve personen. Virusdeeltjes werden geïdentificeerd door p24 ELISA. Exosomes werden geïdentificeerd op basis van exosome markers acetylcholinesterase (AChE), en de CD9, CD63 en CD45 antigenen. Onze gradiënt procedure leverde exosome voorbereidingen virus- deeltjes. De efficiënte zuivering van exosomen uit menselijk plasma konden wij het gehalte aan plasma-afgeleide exosomes onderzoeken en hun immuunsysteem modulerende potentie en andere biologische functies te onderzoeken.
Introduction
De HIV-1-epidemie blijft een belangrijke invloed in de hele wereld hebben. Met ingang van 2013, ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd werden met hiv, en 2,1 miljoen daarvan waren nieuw geïnfecteerden 1. Preventiestrategieën en een betere toegang tot antiretrovirale therapie zijn nuttig in het verminderen van de totale overname van HIV geweest. Er zijn echter individuele populatie nog steeds ervaren stijgingen in de overname van HIV-1. Aldus is er een behoefte aan verdere inspanningen om deze epidemie.
Eén van de sterkste voorspellers van HIV progressie van de ziekte chronische immuunactivatie (CIA) 2-10. Bepaald door voortdurend hoge detecteerbare cytokines en verhoogde expressie merkers op het oppervlak van T-lymfocyten, is CIA toegeschreven aan: i) continue dendritische cel productie van type I IFN 11; (ii) directe immuunactivatie gedreven door HIV eiwitten Tat, Nef en gp120 12; (iii) Translocatie van bacteriële eiwitten in darm geassocieerd immuuncellen 6. De exacte mechanisme (s) onderliggende chronische systemische immuunactivatie in HIV-infectie nog volledig worden opgehelderd.
Onze onderzoeksgroep en anderen hebben een rol van exosomes bij HIV pathogenese 15-18 aangetoond. Onze fractie heeft vastgesteld dat Nef-eiwit wordt uitgescheiden uit de geïnfecteerde cellen in exosomes 15 en exosomaal Nef (exNef) aanwezig in het plasma van HIV-geïnfecteerde individuen in nanogram niveau 18 is. We hebben aangetoond dat omstander CD4 + T-cellen blootgesteld aan exNef resulteerde in activatie geïnduceerde celdood afhankelijk van de CXCR4 traject 19, 20. Alternatief, monocyt / macrofagen waren ongevoelig voor exNef-geïnduceerde apoptose, maar vertoonde veranderde cellulaire functies en cytokine expressie. Onlangs heeft onze groep getoond exosomes geïsoleerd uit plasma van HIV-geïnfecteerde individuen bevatten een verscheidenheid van cytokines. Further, naïeve perifere mononucleaire cellen blootgesteld aan plasma bereide exosomes uit HIV-geïnfecteerde patiënten geïnduceerde expressie van CD38 op naïeve en memory CD4 + centrale en CD8 + T-cellen. Dit zal waarschijnlijk bijdraagt aan systemische ontsteking en virale propagatie via bystander celactivering 21, en stelt exosomes spelen een belangrijke rol bij HIV-pathogenese.
In het onderzoek naar de rol van exosomes bij HIV pathogenese, is een uitdaging ontwikkelen van technieken om efficiënt scheiden exosomes van HIV-deeltjes terwijl de exosomaal inhoud en hun functionele immune modulerende vermogen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren van exosomen uit celkweek en biologische vloeistoffen 22,23. Vanwege hun kleine omvang en lage dichtheid (exosomes drijven met een dichtheid van 1,15 – 1,19 g / ml), differentiële ultracentrifugatie en / of ultrafiltratie zijn de meest gebruikte technieken voor het isoleren exosome 23.Echter, HIV-geïnfecteerde celkweek supernatanten en plasma van patiënten bevatten zowel exosomes en HIV-1 virale deeltjes. Exosomes en HIV-1 deeltjes zeer vergelijkbaar in grootte en dichtheid. Als alternatief, gebruik te maken van de expressie van unieke exosomaal markers zoals CD63, CD45 en CD81, exosomes zijn geïsoleerd met behulp immunoaffiniteits- capture methoden 23. Deze procedure kan virus scheiden van exosomes. Echter, het nadeel van deze techniek is de strakke binding van antilichamen tegen het gezuiverde exosomes, die kunnen interfereren met de beoordeling van de immuunmodulerende potentieel van exosomes in kweek.
Om deze beperkingen te pakken we een procedure voor de zuivering van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma modificatie van Cantin en collega's 22 gebruikt iodixanol snelheidsgradiënten ontwikkeld. Exosomes bleken te scheiden in de low-density / bovenste fracties van iodixanol hellingen, terwijl virusdeeltjes gescheiden in de hoog-dichtheid / lagere fracties. Virusdeeltjes werden geïdentificeerd door p24 ELISA en exosomes werden geïdentificeerd met behulp van exosome markers AChE, CD9, CD63 en CD45. De bovenste lage dichtheid fracties verzameld bevatte exosomes die negatief voor HIV-1 p24 besmetting waren. De efficiënte zuivering en scheiding van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma een accurate onderzoek van de inhoud van exosomen uit menselijk plasma en het onderzoeken van hun immuunsysteem modulerende potentiaal en de diagnostische en prognostische waarde van exosomen in HIV-1 pathogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chronische immuunactivatie (CIA) en CD4 + T cel depletie twee belangrijke kenmerken van HIV-1-infectie. Ze zijn gevestigd als voorspellers voor de pathogenese, met de CIA als de beste voorspeller. De onderliggende mechanismen die chronische systemische immuunactivatie en CD4 + T-cel afname nog niet volledig opgehelderd. Wij en andere laboratoria hebben harde bewijzen ontwikkeld dat exosomes afgescheiden van HIV-1 geïnfecteerde cellen spelen een rol in zowel kenmerken.
De aanhoudende interes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
