Summary

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Published: January 05, 2016
doi:

Summary

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Abstract

Exosomes هي حويصلات صغيرة يتراوح حجمها ما بين 30 نانومتر إلى 100 نانومتر التي تم إصدارها على حد سواء بشكل جوهري وعلى التحفيز من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وهي توجد في عدد من السوائل البيولوجية ومعروفة لتنفيذ مجموعة متنوعة من البروتينات، والدهون، وجزيئات الحمض النووي. كان يعتقد في البداية أن يكون قليلا أكثر من الخزانات لالحطام الخلوي، وأعرب عن تقديره للأدوار exosomes تنظيم العمليات الحيوية والأمراض على نحو متزايد.

وقد وصفت عدة طرق لعزل exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلوي والسوائل البيولوجية. ونظرا لصغر حجمها ومنخفض الكثافة، والفرق تنبيذ فائق و / أو الترشيح الفائق هي التقنيات الأكثر شيوعا لexosome العزلة. ومع ذلك، البلازما من HIV-1 الأفراد المصابين يحتوي على كل exosomes والجسيمات الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية، والتي تتشابه في الحجم والكثافة. وهكذا، كان الفصل الفعال للexosomes من فيروس نقص المناعة البشرية الجسيمات الفيروسية في البلازما البشريةتحدي.

لمعالجة هذا القيد، وضعنا إجراء تعديل من Cantin وآخرون. آل.، 2008 لتنقية exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية. استخدمت Iodixanol تدرجات السرعة للفصل exosomes من HIV-1 الجزيئات في البلازما من HIV-1 الأفراد إيجابي. وقد تم تحديد جزيئات الفيروس عن طريق P24 ELISA. وقد تم تحديد Exosomes على أساس علامات exosome أستيل (أستيلكولينستراز)، والمضادات CD9، CD63، CD45 و. أسفرت إجراءات متدرجة لدينا الاستعدادات exosome خالية من جزيئات الفيروس. تنقية فعالة من exosomes من البلازما البشرية مكنتنا من فحص محتوى exosomes المشتقة من البلازما وللتحقيق إمكاناتهم تغييري المناعة ووظائف بيولوجية أخرى.

Introduction

لا يزال وباء HIV-1 أن يكون لها تأثير كبير في جميع أنحاء العالم. اعتبارا من عام 2013، ما يقرب من 35 مليون شخص في العالم يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية، وكانت 2.1 مليون من هؤلاء الأفراد المصابين حديثا 1. وكانت استراتيجيات الوقاية وزيادة فرص الحصول على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية مفيدة في الحد من الاستحواذ الكلي لفيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، السكان الفردية لا تزال تعاني من ارتفاع في اكتساب HIV 1. وبالتالي، هناك ضرورة استمرار الجهود المبذولة لمعالجة هذا الوباء.

واحدة من أقوى تنبئ تطور المرض فيروس نقص المناعة البشرية هو تنشيط جهاز المناعة المزمن (CIA) 10/02. التي تحددها مستويات عالية باستمرار السيتوكينات يمكن اكتشافها وعلامات التعبير مرتفعة على سطح الخلايا الليمفاوية T، وقد نسبت وكالة المخابرات المركزية إلى: ط) المستمر انتاج الخلايا الجذعية من النوع الأول الإنترفيرون 11؛ (ب) تنشيط جهاز المناعة المباشر مدفوعا بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية تات، نيف وgp120 12؛ (ج) النبات من البروتينات البكتيرية في الأمعاء المرتبطة الخلايا المناعية 6. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة (ق) الكامنة المزمنة، تنشيط جهاز المناعة النظامية في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية لا يزال يتعين توضح تماما.

وقد أظهرت مجموعتنا البحثية وغيرها من دور exosomes في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية 15-18. وقد قررت مجموعتنا أن البروتين نيف يفرز من الخلايا المصابة في exosomes 15، وexosomal نيف (exNef) موجود في البلازما من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية على المستويين نانوغرام 18. لقد أثبتنا أن المارة أدت CD4 + T-الخلايا المعرضة لexNef في الناجم عن تنشيط الخلايا الموت تعتمد على مسار CXCR4 19، 20. بدلا من ذلك، كانت الوحيدات / الضامة الحرارية إلى موت الخلايا المبرمج exNef التي يسببها، ولكن عرضت الوظائف الخلوية المعدلة وخلوى التعبير. exosomes وفي الآونة الأخيرة، وقد أظهرت مجموعتنا معزولة من بلازما الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية تحتوي على مجموعة متنوعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات. فوrther، وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية ساذجة تتعرض لexosomes المشتقة من البلازما من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية الناجمة عن التعبير عن CD38 على خلايا الذاكرة من السذاجة ووسط CD4 + CD8 + T و. هذا من المرجح أن يساهم في الالتهابات الفيروسية ونشر عن طريق تنشيط الخلايا المارة 21، ويشير إلى أن exosomes تلعب دورا هاما في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية.

في التحقيق في دور exosomes في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية، يتمثل أحد التحديات هو تطوير تقنيات لexosomes منفصلة بكفاءة من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية مع الحفاظ على المحتوى exosomal فضلا عن قدرتها الوظيفية تغييري المناعية. وقد وصفت عدة طرق لعزل exosomes من زراعة الخلايا والسوائل البيولوجية 22،23. بسبب صغر حجمها وانخفاض الكثافة (exosomes تطفو في كثافة 1،15-1،19 ز / مل)، تنبيذ فائق الفرق و / أو الترشيح الفائق هي التقنيات الأكثر شيوعا لexosome العزلة 23.ومع ذلك، بفيروس نقص المناعة البشرية supernatants زراعة الخلايا والبلازما المرضى تحتوي على كل exosomes وHIV-1 الجسيمات الفيروسية. Exosomes وHIV-1 الجسيمات متشابهة جدا من حيث الحجم والكثافة. بدلا من ذلك، والاستفادة من التعبير عن علامات exosomal فريدة من نوعها مثل CD63، CD45، CD81 و، وتم عزل exosomes باستخدام طرق أسر immunoaffinity 23. هذا الإجراء يمكن أن تفصل الفيروس من exosomes. ومع ذلك، فإن عيوب هذه التقنية هو مرفق ضيق من الأجسام المضادة للexosomes النقاء، والتي يمكن أن تتداخل مع تقييم القدرة المناعية للexosomes في الثقافة.

لمعالجة هذه القيود، وضعنا الداخلي لتنقية exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية المعدلة من Cantin وزملاء العمل 22 باستخدام Iodixanol تدرجات السرعة. تم العثور على Exosomes للفصل في منخفض الكثافة / الكسور العليا من التدرجات iodixanol، في حين أن جزيئات الفيروس قد فصلت في عاليةالكثافة / أقل الكسور. وقد تم تحديد جزيئات الفيروس عن طريق P24 ELISA وتم تحديد exosomes باستخدام علامات exosome اشي CD9، CD63، CD45 و. العلوي الكسور منخفض الكثافة جمعت الواردة exosomes التي كانت سلبية للتلوث HIV-1 P24. تنقية فعالة وفصل exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية يسمح للفحص دقيق لمحتوى exosomes المشتقة من البلازما البشرية فضلا عن التحقيق في إمكاناتهم تغييري المناعية والقيمة التشخيصية والنذير من exosomes في HIV-1 المرضية.

Protocol

ويرد المخطط العام لإجراء العزل exosome والتنقية في الشكل 1. تم الحصول على الدم الكامل من المتبرعين الصحية والمقدمة من الأفراد المصابين بالفيروس لا يتلقون theraoy المضاد للفيروسات القهقرية حضور عيادة الأمل من جامعة إيموري وبرنامج الأمراض المعدية من النظام الصحي ج?…

Representative Results

وطهروا بكفاءة Exosomes من HIV-1 البلازما البشرية إيجابي. exosomes معزولة، التي حددها أستيل (أستيلكولينستراز) النشاط، مفصولة في أقل كثافة الكسور 1-3 في الجزء العلوي من التدرجات iodixanol، في حين أن جزيئات الفيروس، التي حددها HIV-1 مستضد P24 ، فصل في الكسور ذات ?…

Discussion

تنشيط المناعة المزمن (CIA) وCD4 + T استنزاف خلية نوعان من السمات الهامة المميزة للعدوى HIV-1. وقد أنشئت على أنها تنبئ عن المرضية، مع CIA كونه أفضل تنبؤ. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء القيادة تنشيط جهاز المناعة النظامية المزمن وانخفاض خلايا CD4 + T تزال لم توضح تماما. نحن ومخت?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Materials

BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

References

  1. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
  2. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
  3. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
  4. Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
  5. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
  6. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
  7. Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
  8. Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
  9. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
  10. Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
  11. O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
  12. Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
  13. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  14. Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
  15. Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
  16. Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
  17. Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
  18. Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
  19. James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
  20. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
  21. Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
  22. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
  23. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  24. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  25. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
  26. Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).

Play Video

Cite This Article
Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

View Video