JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Трехмерных изображений и анализ митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Этот протокол использует трехмерные (3D) методы визуализации и анализа для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Методы применяются в других ситуациях, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать подмножество данных из другой флуоресцентного сигнала.

Abstract

Целью настоящего Протокола является изучение митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон. Таким образом 3D визуализации и анализа методов были разработаны для изолировать нерва конкретных митохондрии и оценивать болезнь индуцированные изменения митохондрий в дистального наконечника сензорных нервах. Протокол сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимии, конфокальная микроскопия и методы анализа 3D изображение для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Подробные параметры определяются на протяжении процедуры для того, чтобы обеспечить конкретным примером того, как использовать эти методы для изоляции нервных специфичные митохондрий. Антитела были использованы для обозначения нерва и митохондриальной сигналов в рамках разделов ткани кожи пунш биопсий, который последовал непрямой иммунофлюоресценции для визуализации нервы и митохондрии с зеленым и красным флуоресцентного сигнала соответственно. Z-серии изображения были приобретены с помощью конфокальной микроскопии и программное обеспечение для 3D-анализа была использована для обработки и анализа сигналов. Это не обязательно следовать точные параметры, описанные в, но важно соответствовать те выбрали во всем окрашивание, сбора и анализа данных шаги. Сила настоящего Протокола является, что это применимо к самые разнообразные обстоятельства, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать других сигналов, которые в противном случае будет невозможно учиться самостоятельно.

Introduction

Митохондрии служат жизненно важные клеточные функции, которые включают производство энергии клеток, буферизация кальция и регулирование некротические и apoptotic клеток смерти1,2,3. Нервная система имеет высокую скорость метаболизма, по сравнению с тела4 , предполагая, что нейроны генерировать высокий уровень клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) через митохондриальное дыхание. Много доказательств документы, что нейронные функции зависят от АТФ5, особенно на синапсы6. Таким образом распределение митохондрий в пределах нейронов имеет важное значение.

За последние 10 лет много информации показал, торговлей и стыковка нейрональных митохондрий жестко регламентируется. Моторные белки участвуют в распространении митохондрий конкретных сотовых отделений во всем нейроном. Торговля митохондрий особенно важна, потому что нейроны проекта аксонов и дендритов вдали от Сома. Кинезин моторов белков главным образом прямые, антероградная (от soma) торговля митохондрий вдоль микротрубочек во время Динеин моторов белков прямой ретроградным (в сторону сома) моторики7,8,9 , 10. Существует клеточных сигналов такой митохондриальной мембранного потенциала и проводимости импульса, которые влияют на наличие и направление митохондриальной людьми11,12,13.

Помимо транспортировки митохондрий, существуют специализированные белки для локализации митохондрий для конкретных клеточных отсеков, которые предъявляют требования высокой энергии, таких как узлы по Ranvier и синапсы8,14, 17. В самом деле, большинство из митохондрий в пределах аксоны являются не подвижные9,13,18. Специализированные белки, как syntaphilin якорь митохондрий в микротрубочки вдоль аксоны в то время как другие белки митохондрий якорь в Цитоскелет актина19–21. Факторы роста и ионов, таких как кальций были зарегистрированы в поддержку прекращения движения митохондрий локализовать их в районы, где они являются необходимой21,22,23.

Взятые вместе, торговли людьми и закрепления митохондрий жизненно важное значение для надлежащего функционирования нейронов. В поддержку этого нарушения в митохондриальной людьми была связана с нескольких неврологических условий включая болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб, болезнь Хантингтона, наследственные спастический парезами и атрофия зрительного нерва15,24,25,,2627. Недавние исследования были сосредоточены на митохондриальной дисфункции и патологии как потенциального механизма для диабетической невропатии, сенсорные потери, связанные с диабетом28,,2930,31 ,32,33. Гипотеза является, что диабет изменяет распределение митохондрий в пределах сенсорные прогнозы конца кожный нерв. Таким образом метод был разработан для визуализации и количественно митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон (IENFs), дистальная советы корень спинной ганглий сенсорные афферентов. Техника сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимия конкретных митохондриальных и нервных волокон этикетки с приобретением confocal микроскопии z серии сигналов с мощным 3D изображений программное обеспечение для анализа для измерения распределения нерва конкретных Митохондрии от человека кожный пробивать биопсии для достижения этой цели.

Protocol

биопсия кожи удар были получены от предметов, которые были набраны из сети большой первичной помощи на базе общин в университете штата Юта диабет-центр (Солт-Лейк-Сити, UT). Это исследование было утверждено институциональных Наблюдательный Совет университета Мичигана и соблюдает принц?…

Representative Results

Визуализация и количественная оценка митохондрий в человека IENFs Флуоресценции иммуногистохимия позволяет одновременное маркировки множества сигналов для визуализации нервы, митохондрии и ядер в пределах биопсии кожи челов…

Discussion

Этот протокол предназначен для изолировать, количественной оценки и анализа размера и распределения нерва конкретных митохондрий в IENFs в 3D от биопсии кожи человека. Есть несколько важных шагов в протоколе. Свободно плавающего флуоресценции иммуногистохимия предназначен для пятен и а?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов K08 NS061039-01A2, программа для неврологии исследований & открытия и A. Альфред Таубман медицинский научно-исследовательский институт в университете штата Мичиган. Эта работа использовала морфологии и ядро анализа изображения Мичиган диабет исследовательского центра, финансируемые национальными институтами здравоохранения грант 5P 90 DK-20572 от национального института диабета и пищеварения и болезни почек. Авторы хотели бы поблагодарить Дж. Робинсон Синглтон и а. Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцов кожи человека.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image