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Neuroscience

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.

Introduction

Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper4 darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP5, vor allem bei den Synapsen6abhängig sind. Die Verteilung der Mitochondrien innerhalb von Neuronen sind deshalb wichtig.

In die letzten 10 Jahren, die eine Vielzahl von Informationen, dass gezeigt hat der Handel und das Andocken des neuronalen Mitochondrien, ist streng reglementiert. Motorproteine sind bei der Verteilung der Mitochondrien zu spezifischen zellulären Fächer in das Neuron beteiligt. Handel mit Mitochondrien ist besonders wichtig, weil Neuronen Axone und Dendriten fernab der Soma-Projekt. Motorproteine Kinesin direkt in erster Linie Anterograde (Weg von der Soma) Handel mit Mitochondrien entlang der Mikrotubuli während Dynien Motorproteinen direkte retrograde (in Richtung der Soma) Motilität7,8,9 , 10. Zelluläre Signale gibt es solch eine mitochondriale Membranpotential und Impuls-Leitung, die Einfluss auf das Vorhandensein und die Richtung der mitochondrialen Menschenhandel11,12,13.

Neben Mitochondrien zu transportieren, gibt es spezielle Proteine, Mitochondrien zu spezifischen zellulären Kompartimenten zu lokalisieren, die hohen Energiebedarf, wie Knoten von Ranvier und Synapsen8,14, 17. In der Tat, die meisten von Mitochondrien in Axonen sind nicht bewegliche9,13,18. Spezielle Proteine wie Syntaphilin Anker Mitochondrien Mikrotubuli entlang der Axone während andere Proteine Anker Mitochondrien an den Aktin-Zytoskelett19–21. Wachstumsfaktoren und Ionen wie Calcium wurden berichtet, um die Einstellung der Mitochondrien Bewegung sie Regionen lokalisieren wo sie benötigte21,22,23sind zu unterstützen.

Zusammengenommen, sind Menschenhandel und docking der Mitochondrien entscheidend für die richtige Funktion der Neuronen. Zur Unterstützung dieser wurde Unterbrechung des mitochondrialen Handel mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit, Huntington Krankheit, erbliche spastische Paraparese und Optikusatrophie15,24,25,26,27. Neuere Studien konzentrierten sich auf mitochondriale Dysfunktion und Pathologie als ein möglicher Mechanismus für diabetische Neuropathie, die sensorische Verlust im Zusammenhang mit Diabetes28,29,30,31 ,32,33. Die Hypothese ist, dass Diabetes die Verteilung der Mitochondrien innerhalb der sensorischen Projektionen der kutanen Nervenendigung verändert. Daher wurde eine Technik entwickelt, um zu visualisieren und zu quantifizieren Mitochondrien innerhalb der Intraepidermal Nervenfasern (IENFs), die distalen Spitzen der Dorsal Root Ganglion sensorischen Afferenzen. Die Technik kombiniert Fluoreszenz Immunohistochemistry spezifische mitochondriale und Nervenfaser Etiketten mit konfokalen Mikroskopie Z-Serie Erwerb von Signalen mit leistungsstarken 3D Bildanalyse-Software zur Messung der Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien von menschlichen kutanen Stanzbiopsien zur Erreichung dieses Ziels.

Protocol

Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test. 1. Fluoreszenz Immunohistochemistry Prepare Stanzbiopsien für Intraep…

Representative Results

Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. A…

Discussion

Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08 NS061039-01A2, The Program für Neurologie Forschung & Entdeckung und A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Dabei verwendet die Morphologie und die Bild-Analyse-Kern des Michigan Diabetes Research Center, finanziert durch das National Institute of Health Grant 5P 90 DK-20572 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen. Die Autoren möchte J. Robinson Singleton und A. Gordon Smith (University of Utah) danken, für ihre großzügige Spende von menschlichen Hautproben.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
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