Бактериальные механочувствительных каналы могут быть использованы в качестве mechanoelectrical преобразователей в молекулярно-биологических устройств. Воздушно-капельных интерфейс бислои (бабки), сотовые стиле строительные блоки в таких устройствах, представляют собой новые платформы для включения и стимулирования механочувствительных каналов. Здесь мы демонстрируем новый микропипетки на основе метода формирования DIBs, позволяя изучение механочувствительных каналов при механическом раздражении.
MSCL, А механочувствительных канал большой проводимости (MSC), является вездесущим осмолита выпускной клапан, который помогает бактерии выживают резких Hypo-осмотическое потрясений. Было обнаружено, и строго изучены с помощью метода патч-зажим в течение почти трех десятилетий. Свою основную роль перевода натяжение к клеточной мембране в ответ на проницаемость дает сильный кандидат для работы в качестве датчика mechanoelectrical в искусственных мембран на основе молекулярно-биологических устройств. Работа в качестве строительных блоков для таких устройств, интерфейс капель бислоев (бабки) может быть использован в качестве нового платформы для включения и стимулирования MSCL каналов. Здесь мы опишем метод микропипетки основе сформировать DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL. Этот метод состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных (соосно) боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт, интерфейс липидный бислой являетсяформируется. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждой капли, а также размеры интерфейса двухслойной. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода обеспечивает возможность доставить желаемого колебательный стимул. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе могут быть оценены. Используя эту технику, сообщает первый активность MSCL каналов в системе DIB. Кроме того, MS каналов, деятельность других типов каналов могут быть изучены с помощью этого метода, доказывая, мульти-функциональность этой платформы. Метод, представленный здесь позволяет измерять свойства фундаментальной мембранных, обеспечивает больший контроль над формированием симметричных и асимметричных мембран, и альтернативный способ, чтобы стимулировать и изучить механочувствительных каналов.
В последнее десятилетие, сборка искусственных липидных бислоев была значительно расширенный за счет развития метода двухслойной интерфейса капли. Известный как стабильный и надежный, DIBs ввели себя в качестве альтернативных модельных систем в классической окрашены (Мюллер) и сложенными (Монтал-Мюллера) плоских двухслойных 1. Хотя идея использования капель, чтобы создать бислоев восходит к 1960 2, он не приобрел популярность не до недавнего времени. Первый успешный попытка была сообщили в группе Takeushi 3, а затем в ряде исследований, демонстрирующих формирование двухслойной используя сеть капель группой Бейли 4-6. Совсем недавно, методы инкапсуляции были предложены группой Лео 7-9, который впервые концепция использования DIBs в качестве строительных блоков новых стимулов проблематику материальных систем 10. В предыдущих исследованиях, DIBs доказали свою способность реагировать на электрической 9,11, химческих 10,12, и оптический стимулы 13. Различные биомолекулы с различными стимулами проблематику функциональных были эффективно стимулировали при восстановлении в DIB 10,14. В свете этих успешных попыток важным вопрос, поднятых: может DIB Ответить на механический стимул, когда соответствующие биомолекулы включены? Межфазное силы, действующие на DIB отличаться от тех, в других двухслойной системы 15,16. Таким образом, напряженность в бислой, проведенного капель можно контролировать путем регулирования напряжения на водно-липидный нефтяных интерфейсов; концепция не применяется с нарисованными или сложенными двухслойных системах.
MSCL каналы, широко известные как осмолита выпуска клапанов и основных элементов бактериальной цитоплазматической мембраны, реагируют с увеличением напряженности мембраны 17,18. В случае гипо- осмотическое потрясений, несколько каналов, проживающих в мембране маленькой камере 19 может генерировать масответ SIVE проницаемость быстро отпустите ионы и малые молекулы, экономя бактерий лизиса 20. Биофизически, MSCL хорошо изучена и характеризуется, прежде всего, через технику зажим крупное патч 21-23. Надежные структурные модели, объясняющие механизм стробирования 24,25 MSCL являются предложил на основе кристаллической структуры своего гомолога в 26,27, 28, моделирования и результатов широких экспериментов 24,29-31. Под прикладной натяжения ~ 10 мН / м, закрытый канал, который состоит из жесткой связке трансмембранных спиралей, превращается в кольцо сильно наклоненными спиралями, образующих ~ 28 заполненной водой проводящий пору 21,24,32. Кроме того, было установлено, что гидрофобность плотный ворот, расположенный на пересечении внутренней доменов TM1, определяет порог активации канала 33. Соответственно, было обнаружено, что за счет уменьшения гидрофобности ворот, Tensioп порог может быть снижен 22. Это свойство MSCL возможным проектирование различных управляемых клапанов 34, в первую очередь для целей доставки лекарств. Для всех вышеупомянутых свойств и на основе своей фундаментальной роли перевод клеточной мембраны чрезмерных напряженности в электрофизиологических деятельности, MSCL делает отлично подходит в качестве mechanoelectrical преобразователя в бабки.
В этой статье мы представляем оригинальный микропипетки на основе метода для формирования DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL при механическом раздражении. Мы сообщаем впервые, ответ бабки к механическим раздражением и функциональную восстановления в V23T низкопорогового мутанта MSCL в бабки 35.
Экспериментальная система состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт интерфейс липидный бислой является FOrmed. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждого капель (навалом), а также размеры интерфейса двухслойной. Кроме того, асимметричных мембран с различными липидными композициями в каждой створки может быть легко сформирован. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода, обеспечивает возможность применения запрограммированный одного цикла или колебательный стимул. Напряжение подается на искусственном мембраны через сжатие обеих капель, поддерживающих его. В результате капли деформации, области водно-липидный масла интерфейсов увеличения и одновременно угол между капель уменьшается, что приводит к увеличению мембранного напряжения и переходных активации MSCL. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе можно оценить. Даже если в центре внимания в этой статье на механо-трансдукции свойства DIB, мы также подчеркиваем, что другие типы биомолекулы, такие как аламетицина, могут быть активированы с помощью этой многофункциональной платформы. Мы представляем здесь, все технические аспекты подготовки, сборки и проведения измерений с этого нового метода в шаг за шагом образом.
Mechanosensation означает один из первых сенсорных трансдукции, которые развились в живых организмах. Использование этого явления для изучения и понимания механико-электрические свойства DIB, является важным шагом в направлении функциональных стимулов проблематику материалов. Это предполагает включение и активацию механочувствительных канала, MSCL, в DIB в mechanoelectrical преобразователя и датчика деформации для обнаружения усилить напряженность в интерфейсе липидного бислоя. С другой стороны, функция MS каналов может регулироваться с помощью основных свойств материала липидных бислоев в том числе толщины, внутренней кривизны, и сжимаемости. В свете вышесказанного, методика микропипетки основе представляет собой ценный инструмент, позволяющий исследователю возможность изучать MS каналов в бабки и дает представление о структуре липидный бислой, а также липидно-белковые взаимодействия.
За последние три десятилетияс, патч-зажим был основным методом изучения MS каналов, так как она позволяет зажим напряжения и напряженности. Тем не менее, патч-зажим требует громоздкого оборудования и не подходит для миниатюризации, в собственности, необходимой для проектирования сенсорных и устройств преобразования. DIBs из-за своей простоте, стабильности и компактности представляют собой подходящую среду для изучения активности MSCL. Здесь мы расширим предыдущий прогресс в методах формирования DIB, предложив метод микропипетки основе, с возможностью регулировать размер капель и интерфейс двухслойной, химический состав каждой капли, и напряжение на границе через динамический стимуляции. Техника состоит из крепления водные капельки, содержащие Протеолипосомы, до кончиков соосно противоположные стеклянные капилляры. Капли помещают в ванну с органическим растворителем и при контакте липидный бислой формы на границе раздела.
В микропипетки прикреплены к рiezoelectric генераторы, позволяющие горизонтальное смещение капель. Динамически сжатия капель, приводит к увеличению поверхностного натяжения на границе раздела вода масла и, следовательно, к увеличению двухслойной напряжения. Две основные аспекты этого метода дифференцировать от аналогичных и недавно опубликовал контакт пузырь двухслойная (НБР) техники 37. Используя методику, представленную в данном описании, размер бислой управляется с помощью микроманипуляторами и, таким образом объемы капель остается постоянным, в отличие от метода CBB. Кроме того, методика НБР призывает насосов высокого давления, которые не нужны в методе, представленном в этой статье, что делает его проще и легче построить.
Мы можем включить и стимулировать бактериальную MSCL впервые без использования патча пипетки или химических модификаций 38. Поскольку система способствует образованию надежных асимметричных мембран липидный бислой, что более точно имитирует лIPID асимметрия нашли в биологических мембранах. Это позволяет нам изучать последствия контролируемым составом мембраны или асимметрии о деятельности MSCL. Кроме того, с помощью методов обработки изображений, этот метод позволяет оценить напряженность на границе двухслойной. Эта техника помогает в понимании принципов взаимного между объемной и поверхностной силы в DIB, облегчает измерения основных свойств мембраны, и улучшает понимание MSCL ответ на мембраны напряжение.
Хотя этот метод ведет нас на шаг ближе в сторону биомолекулярной стимулов проблематику материальной системы и в различного физиологического среды для изучения MSCL, существуют ограничения в системе. Напряжение в этой системе не могут быть зажаты в связи с наличием липидного резервуара в форме липосом в каждой капли, который имеет тенденцию уменьшить напряжение на границе раздела масло / вода. Таким образом, в настоящее время механочувствительных каналов может быть стимулированов бабки только в динамическом режиме. Наличие пузырьков воздуха в системе существенно влияет на точность и воспроизводимость экспериментов. Пузырьки воздуха, присутствующие в гидрогелей может привести потери, если электрическое соединение.
В то время как мы описали использование микро-пипетки на основе метода для стимуляции MSCL, технология может быть использована для изучения других типов MS каналов и имеет потенциал, который будет использоваться для изучения исследователей различные биомолекул. Например, аналогичные установки была использована в нашей лаборатории для изучения mechanoelectrical отклика канала свободной поверхности раздела капли двухслойной мембраны. Различные белки могут быть восстановлены и активировать с помощью этой весьма контролируемой установки, принимая во внимание, что воссоздание среды каждого биомолекулы изменяются. Метод, описанный в этой статье затрагивает значительно более широком потенциале приложений, который ограничивается только воображением исследователя.
The authors have nothing to disclose.
Исследования сообщили в данной публикации поддерживается ВВС Управления научных исследований фундаментальных Инициатива Грант FA9550-12-1-0464.
0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | – | |
AxioCam HSm | Carl Zeiss | – | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | – | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
DigiData 1440A system | Molecular Devices | – | |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DPhPC | Avanti | 850356C | |
E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
FPLC System | Pharmacia Biotech | – | |
HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Affymetrix | 17886 | |
IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |