细菌机械敏感性通道可以用作生物分子器件mechanoelectrical换能器。液滴界面双层(的DIB),细胞启发积木这样的设备,代表新的平台,其中包含与刺激机械敏感通道。在这里,我们表现出成形的DIB,允许在机械刺激机械敏感性通道的研究的一个新的微管为基础的方法。
元富,大导机械敏感性通道(MSC),是一种普遍存在的渗压放气阀,可以帮助细菌生存突然低渗冲击。已发现并使用膜片钳技术近30年来严格的研究。其基本转换施加到细胞膜进入渗透性响应张力的作用,使得它的有力候选充当mechanoelectrical传感器在人工膜的基于生物分子器件。作为构建块这样的装置,液滴界面双层(的DIB)可被用作用于加入MsCl通道的掺入和刺激的新平台。在这里,我们描述了微量基法来形成的DIB和测量的掺入MSCL通道的活性。该方法包括脂质包裹锚定在两个对立(同轴定位)硼硅玻璃微尖水滴的。当液滴接触,脂双层界面是形成。这种技术提供的控制的化学成分和各小滴的大小,以及双层界面的尺寸。具有连接到谐波压电致动器的微量之一提供递送所期望的振荡的刺激的能力。通过变形时的微滴的形状的分析,在界面产生的张力可以被估计。使用这种技术,将报告的MsCl通道在一个DIB系统的第一活性。此外MS频道,其它类型的信道的活动可以使用该方法进行研究,证明这一平台的多功能性。这里介绍的方法,使产生基本膜性能的测量,提供了更大的控制对称和非对称膜的形成,并且是刺激和研究机械敏感性通道的另一种方法。
在过去的十年中,人工脂质双层大会已基本穿过液滴界面双层方法的发展推进。被称为稳定和强大,征收的DIB自己作为替代模型系统,以古典彩绘(穆勒)和折叠(Montal -穆勒)平面双层1。虽然使用滴创建脂质双层的想法可以追溯到20世纪60年代2,它并没有得到普及,直到最近。第一次成功尝试被报道由Takeushi组3,接着几项研究表明使用液滴的网络由贝利组4-6双层形成。最近,提出了利奥集团7-9,谁率先使用的DIB作为新的刺激响应材料系统10积木概念的封装技术。在以前的研究中,的DIB证明其电气9,11,化学反应能力的iCal 10,12,和光刺激13。各种生物分子与不同的刺激响应功能都当在DIB 10,14重组得到有效激发。鉴于这些成功的尝试的一个重要问题是提出:可以以机械刺激的响应DIB在适当的时候将生物分子结合?作用在一个DIB的界面力不同于其它双层系统15,16不同。因此,在由液滴保持的双层的张力可以通过调节张力在水 – 脂质 – 油界面进行控制;概念不适用与油漆或折叠的双层系统。
元富渠道,广泛地称为渗透调节物质的释放阀和细菌胞浆膜的基本要素,应对增加的膜张力17,18。在低渗震荡时,驻留在一个小细胞的膜几个通道 19可以生成一个马斯西伯渗透性响应迅速释放离子和小分子,从20裂解节省细菌。生物物理,元富被很好地研究,并通过突出的膜片钳技术21-23特点为主。可靠的结构模型解释元富的门控机制24,25是根据它的同系物的晶体结构26,27,造型28,以及大量的试验24,29-31结果提出。下的〜施加的张力为10mN / m时,封闭通道它由跨膜螺旋的一紧捆的,转变成的大大倾斜螺旋形成一〜28充满水的导电孔21,24,32的环。还已经确定,紧栅的疏水性,位于内TM1域的交叉点,确定信道33的激活阈值。相应地,人们发现,通过降低栅极的疏水性,所述tensioN门限可以降低22。的MsCl的这种特性成为可能的各种控制阀门34的设计,主要用于药物递送的目的。对于上述所有特性,并根据翻译细胞膜过度紧张到电活动的基础性作用,元富使得非常适合作为mechanoelectrical换能器的DIB。
在这篇文章中,我们提出了一个原始的微管为基础的方法来形成的DIB和衡量下的机械刺激所并入元富渠道的活动。我们报告的第一次,的DIB的机械刺激和加入MsCl中的DIB 35 V23T低阈突变体的功能重建的响应。
实验系统由脂质包裹锚固到两个相对的硼硅酸盐玻璃微尖端含水液滴。当液滴接触脂质双层界面为foRmed指。这种技术提供控制每个液滴(散装)的化学组成和大小,以及双层界面的尺寸。此外,非对称膜,在每个小叶各种脂质组合物可以很容易地形成。具有连接到谐波压电致动器的微量之一,提供了以应用预编程单周期或振荡刺激的能力。张力通过两个液滴支撑它的压缩输送到人工膜。作为液滴变形的结果,水 – 脂质 – 油界面的增加,同时液滴之间的角度的区域减小,导致增加膜张力和短暂的MsCl活化。通过变形时的微滴的形状的分析,在界面产生的张力可以被估计。尽管本文中的重点是在DIB的机械性转导性质,我们也强调,其他类型的生物分子,如丙甲菌素,可通过将本多功能平台被激活。我们在座的,准备,组装,并进行测量,在一步一步地这一新方法的所有技术问题。
机械感觉表示第一感官转导通路,在生物体进化中的一个。利用此现象对于研究和理解DIB的机械 – 电性能,是向着官能刺激响应材料的关键步骤。它涉及到一个机械敏感性通道,加入MsCl,在DIB作为mechanoelectrical传感器和应变仪来检测张力增加脂质双层界面的掺入和激活。在另一方面,MS通道的功能可以通过脂质双层包括厚度,内在曲率,和压缩的基本材料特性进行调节。鉴于前述的,微量移液器为基础的技术提供了一种有价值的工具,允许研究者研究MS通道中的DIB和提供了深入了解脂双层的结构,以及脂质 – 蛋白质相互作用的能力。
在过去的三十年S,膜片钳是主要的方法来研究的MS信道,因为它允许这两个电压和张力的夹紧。然而,膜片钳需要庞大的设备,不适合小型化,需要的感觉和转换装置的工程的属性。由于其简单性,稳定性和紧凑的DIB表示一个合适的环境,研究的MsCl的活性。在这里,我们通过提出一种微量为基础的技术,用来控制液滴和双层接口的大小,每个液滴的化学组成,以及通过动态刺激张力界面处的能力延伸在DIB形成技术以前的进步。该技术包括固定水滴,含蛋白脂质体,以同轴反对玻璃毛细管的提示。液滴被放置在有机溶剂的浴接触时带来了脂质双层形式在界面处。
的微量附着为piezoelectric振荡器,使液滴的水平位移。动态压缩液滴,结果在增加界面张力在水油界面,因此,增加了双层张力。两个主要方面区别于同类和最近公布的接触泡沫双层(CBB)技术,37这个方法。使用本文中所呈现的技术中,双层的大小使用而被控制显微操作,因此,液滴的体积保持恒定,不像在CBB方法。此外,CBB技术要求的压力泵,其不需要在本文使其更简单,更容易建立提出的方法。
我们能够掺入和刺激细菌的MsCl首次不使用一膜片吸管或化学修饰38。由于该系统有助于鲁棒不对称脂双层膜的形成,它更紧密地模仿升IPID不对称生物膜中。这让我们来研究的MsCl的活性控制的膜组合物或不对称的效应。此外,通过图像处理技术,这种方法有助于估计张力在双层界面。在理解的DIB体积和表面力之间相互转换的原则,这种技术的助攻,促进基本膜性能的测量,并提高响应元富的理解,对膜的张力。
虽然这种方法使我们更近一步向生物分子刺激响应材料体系和不同的生理环境,研究的MsCl,有限制的系统。张力在此系统不能被由于脂质贮存在各小滴,这往往会缓解张力在油/水界面脂质体的形式存在夹紧。因此,目前机械敏感性通道可刺激在的DIB只在一个动态的制度。气泡在系统中存在显著影响实验的精度和再现性。存在于水凝胶的气泡可能导致的损失,如果电连接。
尽管我们描述了使用微吸管基于方法的MsCl的刺激,该技术可以被用来研究其它类型的MS的信道,并具有要使用的研究人员研究了各种生物分子的潜力。例如,类似的设置已使用在我们的实验室研究一个信道的无液滴界面双层膜的mechanoelectrical响应。各种蛋白质可重构和使用这种高度控制的设置激活时,也要考虑到各个生物分子的重构环境而变化。本文中介绍的方法倒是一个相当广泛的应用潜力仅限于研究人员的想象。
The authors have nothing to disclose.
研报本出版物中是通过科学研究基本计划资助FA9550-12-1-0464空军办公室的支持。
0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | – | |
AxioCam HSm | Carl Zeiss | – | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | – | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
DigiData 1440A system | Molecular Devices | – | |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DPhPC | Avanti | 850356C | |
E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
FPLC System | Pharmacia Biotech | – | |
HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Affymetrix | 17886 | |
IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |