We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
炎症の基本的プロセスの1つが、周囲の組織への血管の内腔からの免疫細胞の浸潤です。これは、内皮細胞、線血管は、例えば、単球などの免疫細胞の循環への接着性になったときに発生する。この接着性のインビトロ測定は、これまで、直接カウントとして内皮層に付着した単球の数を定量することによって行われていますまたは接着性単球の蛍光を間接的に測定することによって。このような測定は、内皮細胞集団の平均密着性を示す行うが、それらは、細胞の数などの要因の数によって混乱しており、実際に接着剤である内皮細胞の割合を明らかにしません。ここでは、説明し、内皮単層の試験された集団内の接着細胞の列挙を可能にする方法を示しています。内皮細胞はカバーガラス上で増殖させ、所望の次の治療は、(蛍光標識することができる)、単球で攻撃しています。インキュベーション後、浸漬および排水の複数ラウンドを含むすすぎ手順は、細胞が固定されています。単球によって囲まれている接着性内皮細胞は、容易に識別され、接着剤である集団内の内皮細胞の実際の割合を明らかに密着度を与えて、列挙されています。
このような血管を裏打ちする内皮細胞層を横切る単球などの免疫細胞の浸潤は、炎症1のプロセスの重要なステップです。これは、損傷部位への免疫細胞(免疫細胞)のホーミングを可能にします。例えば、冠状動脈と頸動脈などの他のインスタンスと場所において、内皮層を介して単球の浸潤は、潜在的にプラーク2の形成をもたらす、動脈壁におけるこれらの細胞の望ましくない長期居住につながることができます。免疫細胞浸潤のすべての場合において、最初のステップは、血管の局所領域における内皮細胞の活性化を伴います。内皮細胞は、内皮細胞表面3に免疫細胞の動員および取り付けを容易VCAM、ICAMおよびE-セレクチンなどの細胞表面タンパク質の発現を増加させるために、このようなTNF-α及びIL-6などの炎症性サイトカインによって活性化されます6。
<p cLASS = "jove_contentは">最初に、内皮細胞の接着の測定は、単層7内皮に接着単球を計数することにより行いました。精度の点で、この方法の制限は、リンパ球または単球の接着4に相当する放射性物質の定量化に続いて放射性標識されたリンパ球や単球の使用につながりました。この方法は、最終的に目的の免疫細胞は、蛍光色素で標識し、代わりに、放射能の蛍光を測定することが8である差分と、上記と同様の操作を行ったことにより、蛍光ベースの方法、取って代わられました。現在、この方法が最も便利なとして浮上している、いくつかの商業的供給業者によってキットの形態で販売されています。このアッセイは、対照と実験サンプルとの密着性の相対的レベルを測定することができますが、それは蛍光の変化は、全体の電子全体の密着性が均一な変化によるものであるかどうかを明らかにしませんndothelial細胞集団または変化は、細胞の亜集団内の接着性の差である場合。これは、洗浄のストリンジェンシーは、結果に大きな影響を及ぼし、さらに重要なことには、別の内皮細胞単層との間に結合していない単球をオフすすぎの均一性は、サンプル間の結果の複製からの結果の近さと再現性に大きく影響することも明らかです。より最近では、内皮細胞単層を横切る媒体に単球ポンプいくつかのシステムでは、この問題9に対処するために使用されました。また、これらのフローシステムはまた、内皮細胞上の剪断力の影響を再現します。このようなシステムの利点は明確で非常に魅力的であるが、急性炎症の場合のように、そのようなそのような電離放射線などのTNFα、いくつかの他の活性剤、などの要因によって、内皮細胞の接着性を大幅に増強することができるがことを理解することも重要です10惹起は、Tを変更します帽子は容易にこれらの非常に厳格なシステムによってin vitroで実験的な時間枠内で検出されていません。内皮細胞の接着性の微小な変化を容易に見逃しまたはインビトロで却下されているが、それは、慢性炎症の特徴であるライフタイム内でこのような小さな変化は、非常に重要な成果を発揮することができる生体内で必ずしも良性ではありません。従って、内皮細胞の接着性を検出し、測定するための堅牢な、まだ感受性、及び具体的な方法が必要とされます。ここでは、直接内皮細胞の接着性を測定するための方法を報告しています。この方法は、内皮細胞の接着性の間接的な代理指標として蛍光測定には依存しません。これは、接着性の変化はすべてのセルにわたって均一変化に起因または亜集団に限定されているかどうかを明らかにする。さらに、このような老化関連β-ガラクトシダーゼ、細胞生存率擦傷などのマーカーとの内皮細胞の共染色を可能にしますKER、Calcien AMと特定の細胞状態または特定のタンパク質の発現の個々の接着剤、内皮細胞の結合を可能にする細胞表面および細胞内タンパク質に対する抗体。
上述の単球接着アッセイは、内皮単層10の上に電離放射線の生物学的効果を研究するために設計された実験に首尾よく使用されました。これは内皮単層の密着性を評価するために利用可能な唯一の方法ではありませんが、それは接着剤である、単層内の内皮細胞の割合またはパーセンテージの定量化を可能にする唯一の方法です。他の方法により測定されるような単球の接着のグローバル量的変化は、内皮単層の全ての細胞の接着性の一般的上昇または内皮細胞の亜集団の増加接着性のいずれかに起因することができますので、これは重要な違いです上記の例に示すように、単分子層内にあります。この情報を有する値は照射後の密着性強化を示した内皮細胞のパーセンテージを定量化する能力は、INESにつながっているという事実が挙げられます接着した細胞の割合が大きく(1,000倍以上)の上にその用量でX線による遺伝子のランダム突然変異から予想されるものであったように、この効果は、特定の遺伝子の遺伝的変異によるものではないことが可能な結論。
結果の良好な再現性を可能にする要因は、洗浄政権です。洗浄手順は、組織に押し当て、続いて洗浄バッファーにカバーガラスを浸漬することを含むように、必然的に十分に洗浄緩衝液のピペット操作の古い方法に起因するバッファ乱流の変動が回避されます。実際、洗浄工程から変動要素を削除した洗浄手順を考案するために私達を強要ピペット操作方法を用いて得られた複製の間、過度の変動を観察しました。
確かに、n個の操作を行い、単球のクラスターの手動カウントを実行する必要があり、このアッセイ嘘の限界、OTは、ハイスループット分析のためにそれを適合させることを可能にします。第二に、クラスタを構成する方法の多くの単球上の決定は、半任意に決定する必要があり、レベルが高すぎると、いくつかの本物のクラスターの排除をもたらすことができます。この方法では剪断力の欠如は、内皮細胞の接着性が著しく増強され誘導される実験の限界( 例えば、+TNFα)と見なすことができます。それは、接着性の少ない誇張増強の検出を可能にするように他の状況ではしかし、せん断力の欠如は、利点です。単球の接着性の適度な増加は、特に重要と関連する可能性がある。in vivoで 、単球は(典型的な実験時間で)主にせん断力との密着性に適度な増加と内皮細胞に大きな数字に添付することが期待されないであろう。時間におけるしかしながら、いくつかの単球は、おそらくなり、これは、慢性炎症の環境を表現する可能性が高いです。など、それは粘着性のわずかな増加は、せん断応力下で観察することを可能にするのに一般的に短く、おそらくあまりにもつかの間である実験的な時間枠で明らかにされる内皮細胞の接着性の小さい増加の機会を提供するようにせん断力の欠如は有利であることができます。
上で示したように、特定の細胞タンパク質または細胞状態に特異的な内皮細胞の接着性の会合を可能にするような老化アッセイおよび免疫蛍光染色などの他の分析には、このアッセイ後に細胞を供する能力は、機能をこの方法の有用性を増加させます古い接着アッセイでは使用できません。
この方法はEST2不死化ヒト冠状動脈内皮細胞と同様の結果を伴って使用されてきたが、またそれだけで特定の細胞株に特異的でないことを実証し、初代ヒト冠状動脈内皮細胞10を得ました。また、ADO内皮細胞の接着性を分析するこの方法のptionは、標識された免疫細胞の蛍光を測定する標準的な接着アッセイに同じ細胞を施す排除するものではありません。一緒に、この報告書は、この方法は、包括的、汎用性と標準接着アッセイよりもはるかに多くの情報を提供することを示しています。
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |