We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
واحدة من العمليات الأساسية للالتهاب غير تسلل الخلايا المناعية من التجويف من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة بها. يحدث هذا عندما الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية، تصبح لاصقة لتعميم الخلايا المناعية مثل وحيدات. وحتى تم ذلك في المختبر قياس هذا الإلتصاق الآن عن طريق قياس عدد من وحيدات التي تلتزم طبقة بطانة إما العد المباشر أو عن طريق قياس غير مباشر لمضان من حيدات ملتصقة. وفي حين أن هذه القياسات لا تشير إلى متوسط الإلتصاق من السكان الخلايا البطانية، ومرتبك من قبل عدد من العوامل، مثل عدد الخلايا، وعدم الكشف عن نسبة الخلايا البطانية التي هي لاصقة في الواقع. نحن هنا وصف وشرح الطريقة التي تسمح للتعداد خلايا لاصقة داخل الكتلة السكانية اختبار أحادي الطبقة البطانية. تزرع الخلايا البطانية على coverslips الزجاج ويلي المرجوةوتحدى العلاج مع حيدات (التي قد يتم fluorescently المسمى). بعد الحضانة، وإجراء الشطف، التي تنطوي على جولات متعددة من الغمر والصرف الصحي، يتم إصلاح الخلايا. يتم تحديد بسهولة الخلايا البطانية لاصقة، والتي تحيط بها وحيدات وتعداد، وهو ما يعطي مؤشر التصاق أن يكشف عن النسبة الفعلية من الخلايا البطانية في أوساط السكان التي هي لاصقة.
تسلل الخلايا المناعية مثل وحيدات عبر طبقة الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية هو خطوة هامة في عملية الالتهاب 1. وهذا يسمح للصاروخ موجه من الخلايا المناعية (immunocytes) إلى موقع الإصابة. في حالات ومواقع أخرى مثل الشريان التاجي والشريان السباتي، يمكن التسلل من وحيدات من خلال طبقة بطانة يؤدي إلى إقامة غير مرغوبة على المدى الطويل من هذه الخلايا في جدار الشريان، مما قد يؤدي إلى تكوين لويحات 2. في جميع حالات تسلل خلية مناعية، فإن الخطوة الأولى تنطوي على تفعيل الخلايا البطانية في منطقة مترجم من الأوعية الدموية. يتم تنشيط الخلايا البطانية التي كتبها السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل TNF-α و IL-6 لزيادة التعبير عن بروتينات سطح الخلية مثل VCAM، ICAM وE-selectin التي تسهل التوظيف والحجز على immunocytes على سطح الخلايا البطانية 3- 6.
<p cمعشوقة = "jove_content"> في البداية، تم إجراء قياس التصاق الخلايا البطانية بها عد حيدات أن تلتزم البطانية أحادي الطبقة 7. وأدت القيود المفروضة على هذه الطريقة من حيث الدقة في استخدام الخلايا اللمفاوية المسمى الراديو أو الوحيدات، تليها الكمي للمواد المشعة والتي تتطابق مع الخلايا الليمفاوية أو وحيدات التصاق 4. هذه الطريقة حلت محلها في نهاية المطاف من خلال طريقة القائم على مضان، حيث وصفت immunocytes في المصالح مع مضان صبغ وتعرض لنفس الإجراء على النحو الوارد أعلاه مع والفرق بينهما أن مضان بدلا من النشاط الإشعاعي يتم قياس 8. في الوقت الحاضر هذا الأسلوب قد برز بوصفه الأكثر ملاءمة ويباع في شكل مجموعة من قبل العديد من الموردين التجارية. في حين أن هذا الفحص يمكن قياس المستويات النسبية للالإلتصاق بين الضوابط والعينات التجريبية، فإنه لا يكشف ما إذا كان هناك تغيير في مضان يرجع ذلك إلى تغيير موحد في الإلتصاق عبر البريد كاملالسكان الخلية ndothelial أو إذا كان التغيير هو بسبب وجود اختلاف في الإلتصاق بين السكان الفرعي من الخلايا. ومن الواضح أيضا أن التشدد في غسل تمارس تأثير عميق على النتيجة، والأهم من ذلك، فإن توحيد الشطف قبالة حيدات غير منضم بين مختلف الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تؤثر بشكل كبير على التقارب في نتائج مكررات واستنساخ النتائج بين العينات . وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام عدة أنظمة التي تضخ حيدات في وسائل الإعلام عبر أحادي الطبقة البطانية خلية لمعالجة هذه المشكلة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النظم تدفق أيضا ألخص تأثير قوة القص على الخلايا البطانية. في حين أن مزايا هذه الأنظمة واضحة وجذابة للغاية، ومن المهم أيضا أن ندرك أنه في حين أن الإلتصاق الخلايا البطانية يمكن زيادتها إلى حد كبير، كما هو الحال في التهاب حاد، بسبب عوامل مثل TNFα، وبعض المنشطات الأخرى، مثل الإشعاع المؤين 10 انتزاع يتغير رلم يتم الكشف عن قبعة بسهولة داخل الإطارات في المختبر الوقت التجريبية من قبل هذه الأنظمة الصارمة جدا. في حين تغييرات في اللحظة هذه من الإلتصاق الخلايا البطانية وغاب بسهولة أو رفضت في المختبر، فإنه ليس بالضرورة حميدة في الجسم الحي، حيث مثل هذه التغييرات الصغيرة في غضون فترة زمنية الحياة، الذي هو سمة من التهاب مزمن، يمكن أن تمارس نتائج كبيرة جدا. وبالتالي وسيلة قوية، ولكن حساسية، ومحددة لكشف وقياس هناك حاجة الإلتصاق الخلايا البطانية.هنا، ونحن التقرير وسيلة لقياس الإلتصاق من الخلايا البطانية مباشرة. هذه الطريقة لا تعتمد على قياس مضان كمؤشر مركب غير مباشر من الإلتصاق الخلايا البطانية. أنه يكشف ما إذا كانت التغييرات في الإلتصاق ومن المقرر أن التغيير موحد في جميع الخلايا أو تقتصر على سكان الفرعي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح شارك في تلطيخ الخلايا البطانية مع علامات مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز، بقاء الخلية مارسكير، Calcien AM والأجسام المضادة ضد سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا، مما يتيح للجمعية الخلايا البطانية لاصقة الفردية لبعض الدول خلية أو التعبير عن بروتينات معينة.
تم استخدام فحص الوحيدات التصاق المذكورة أعلاه بنجاح في التجارب تهدف إلى دراسة التأثيرات البيولوجية للإشعاع المؤين على الطبقات الوحيدة البطانية 10. على الرغم من أن هذا ليس هو الأسلوب الوحيد المتاح لتقييم الإلتصاق من أحادي الطبقة البطانية، وهو الأسلوب الوحيد الذي يسمح الكمي لنسبة أو نسبة الخلايا البطانية في أحادي الطبقة التي هي لاصقة. هذا تمييز مهم كتغيير الكمي عالميا في التصاق حيدات، كما تم قياسها عن طريق وسائل أخرى يمكن أن تعزى إما إلى الارتفاع العام في الإلتصاق جميع خلايا أحادي الطبقة البطانية أو إلى زيادة الإلتصاق من السكان الفرعي من الخلايا البطانية ضمن أحادي الطبقة، كما هو موضح في المثال أعلاه. ويتمثل قيمة وجود هذه المعلومات من خلال حقيقة أن القدرة لقياس نسبة الخلايا البطانية التي عرضت تعزيز الإلتصاق بعد التشعيع أدى إلى إيناسوكانت النتيجة قادر أن هذا التأثير لا يعود إلى طفرة جينية من الجين على نحو خاص والنسبة المئوية للخلايا التي كانت لاصقة جدا فوق (أكثر من 1000 مرة) ما هو متوقع من طفرة عشوائية من الجينات التي كتبها X-الإشعاع عند هذه الجرعة .
العامل الذي يسمح استنساخ جيدة من النتائج هو نظام الغسيل. كما ينطوي على إجراء الغسيل غمر ساترة الزجاج في غسل العازلة تليها اللمس على الأنسجة، ويتم تجنب التقلبات في الاضطرابات العازلة التي تنشأ حتما من الطريقة القديمة المتمثلة في pipetting لمن غسل العازلة في بئر. في الواقع كان مراقبة التقلبات المفرطة بين مكررات تم الحصول عليها باستخدام أسلوب pipetting لأن أجبرتنا على وضع إجراءات الغسل أن إزالة عنصر التباين من خطوة الغسيل.
باعتراف الجميع، والقيود المفروضة على هذا الاختبار تكمن في الحاجة إلى إجراء العد اليدوي لمجموعات الوحيدات، والتي لا نبعد التمديد يسمح لها أن تتكيف لتحليل إنتاجية عالية. ثانيا، قرار بشأن كيفية تشكل العديد من وحيدات مجموعة أن تحدد شبه تعسفي ويمكن ضبط مستوى عال جدا ويؤدي إلى استبعاد بعض الكتل حقيقية. ويمكن أيضا لعدم وجود قوة القص في هذه الطريقة أن ينظر إليه باعتباره القيد في التجارب التي يسببها الإلتصاق معززة بشكل صارخ من الخلايا البطانية (على سبيل المثال، + TNFα). في حالات أخرى ومع ذلك، فإن عدم وجود قوة القص هي ميزة لأنها تتيح للكشف عن زيادة أقل مبالغ فيه من الإلتصاق. زيادة متواضعة في الوحيدات الإلتصاق يمكن أن تكون ذات أهمية خاصة وذات الصلة. في الجسم الحي، لن (في وقت تجريبي نموذجي) من المتوقع أن نعلق بأعداد كبيرة إلى الخلايا البطانية مع زيادة متواضعة في الإلتصاق، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قوة القص وحيدات. في الوقت ومع ذلك، بعض وحيدات على الارجح، وهذا هو الأرجح لتمثيل البيئة من التهاب مزمن. كما،غياب قوة القص يمكن أن يكون ميزة، حيث أنه يوفر الفرصة لزيادة طفيفة في الإلتصاق الخلايا البطانية ان يعلن في الأطر الزمنية التجريبية التي عادة ما تكون قصيرة، وربما عابرة جدا للسماح زيادة متواضعة في الإلتصاق التي يتعين مراعاتها تحت إجهاد القص.
القدرة على إخضاع الخلايا بعد هذا الاختبار إلى تحليلات أخرى مثل فحص الشيخوخة والمناعي تلطيخ يزيد من فائدة هذه الطريقة لأنها تتيح للجمعية الإلتصاق من الخلايا البطانية محددة لخاصة البروتينات الخلوية أو الدول الخلوية كما هو موضح أعلاه، وهي الميزة التي غير متوفر مع فحوصات التصاق القديمة.
وقد استخدم هذا الأسلوب مع الخلايا التاجية الإنسان خلد est2 البطانية ونتائج مماثلة تم الحصول عليها أيضا مع الخلايا التاجية الإنسان الأساسية البطانية 10، مما يدل على أنه ليس خاصا فقط خط خلية معينة. أيضا، واللغطption هذه الطريقة من معايرة الإلتصاق من الخلايا البطانية لا يحول دون تعريض الخلايا نفسها لفحص التصاق القياسية التي تقيس مضان من immunocytes المسمى. معا، ويوضح هذا التقرير أن هذه الطريقة هي متعددة وشامل ويوفر المزيد من المعلومات من التصاق الفحص القياسية.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |