The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Методика представлена здесь позволяет проанализировать, на каком шаге целевой белок, или, альтернативно, малую молекулу, взаимодействует с компонентами сигнального пути. Метод основан, с одной стороны, на индуцируемой экспрессии специфического белка, чтобы инициировать событие сигнализации на определенном и заранее определенного этапа в выбранной сигнального каскада. Одновременное выражение, с другой стороны, из представляющего интерес гена, то позволяет исследователю оценить, если активность экспрессированного белка-мишени расположена выше по потоку или ниже по потоку от инициированного событием сигнализации, в зависимости от считывания сигнального пути, который получают. Здесь апоптическая каскад была выбрана в качестве определенного сигнального пути, чтобы продемонстрировать функциональность протокола. Патогенные бактерии, такие как Coxiella burnetii, перемещать эффекторные белки, которые мешают клетка-хозяин смерти индукции в клетке-хозяине, чтобы обеспечить выживаемость бактерий в клетки и способствовать ихраспространение в организме. С. burnetii белок эффектор CAEB эффективно подавляет клетки-хозяина смерть после индукции апоптоза с УФ-света или с стауроспорином. Чтобы сузить при котором шаг CAEB мешает распространения сигнала апоптоза, были выражены временно в доксициклин индуцибельной образом выбранные белки с хорошо охарактеризованной проапоптотического деятельности. Если CAEB действует выше этих белков апоптоза будет беспрепятственно продолжаться. Если CAEB действует ниже, гибель клеток будет запрещено. Испытуемые были выбраны белки Bax, который действует на уровне митохондрии, и каспазы 3, который является основным палач протеазы. CAEB мешает гибели клеток, вызванной выражения Вах, но не каспазы 3 выражения. CAEB, таким образом, взаимодействует с каскадом апоптоза между этими двумя белками.
Вирулентность многих грамотрицательных бактериальных патогенов зависит от специализированных систем секреции угнать эукариотических клеток-хозяев. Бактерии используют эти системы секреции вводить бактериальные белки вирулентности (эффекторов) в клетки-хозяина, чтобы модулировать различные клеточные и биохимические деятельности. Изучение эффекторных белков не только при условии, замечательный понимание фундаментальных аспектов принимающих / патогенных взаимодействий, но и в фундаментальной биологии эукариотических клеток 1. Модуляция апоптоза клетки-хозяина, как было показано, является важным механизмом вирулентности в течение многих внутриклеточных патогенов, а также ряд эффекторных белков, модулирующих апоптоз были идентифицированы 2-9. Тем не менее, их точные молекулярные механизмы остаются неизвестными активности во многих случаях.
Апоптоз, форма запрограммированной клеточной смерти, играет важную роль в иммунных реакций на инфекции 10. Два основных пути, ведущие к апоптозу естьбыли определены: таргетинг митохондрий (внутренняя апоптоз) или прямой трансдукции сигнала через гибель клеток рецепторов на мембране (внешняя апоптоза). Внутренняя или митохондрии-опосредованной клеточной смерти путь инициируется внутриклеточных сигналов, и включает в себя активацию Bax и Bak, двух про-апоптотических членов семьи Bcl-2. Это семейство состоит из про- и анти-апоптотических белков регулятора, которые контролируют клеточную гибель 11-14. Активация апоптоза приводит к олигомеризации Bax и Бак с последующей проницаемости митохондриальной наружной мембраны, в результате чего цитохрома C высвобождения в цитоплазму. Цитохром С релиз инициирует активацию эффекторных каспаз 3 и 7 через активацию каспазы 9 в апоптосома 15. Это приводит к протеолиза отдельных подложек, которые, среди прочего, приводит к воздействию фосфатидилсерина на поверхности клеток 16 и освобождает выделенный ДНКазы, что фрагменты чromatin 17,18.
Для того чтобы определить, где в каскаде апоптоза индивидуальный белок эффектор мешает, индуцируемый система экспрессии был использован 19. Регулирующие системы условного выражения трансгенов было бесценным инструментом в анализе функции белка в клетке или его значение для ткани, органа и развития организма, а также при инициации, прогрессировании и поддержание болезни 20-23. Как правило, индуцируемые системы управления, такие как системы Tet 24, используемое здесь, образуют искусственное транскрипционной единицы (рисунок 1). Один компонент представляет собой искусственно сконструированную транскрипционный фактор, называемый TTA (тетрациклин-зависимой транскрипции активатор), образованный слиянием бактериальной транскрипции репрессором TetR 25 до млекопитающих домена белка, который опосредует активацию транскрипции или глушителей 24,26. Второй компонент представляет собой гибридпромоутер, называется TRE (тетрациклин проблематику элемент), состоящий из эукариотической минимального промотора, содержащего, по меньшей мере, ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции, присоединился к нескольким повторами родственного ДНК-связывающего сайта для тетр, Teto 24,25. Третьим компонентом является естественным лигандом TetR, тетрациклина или одного из его производных, таких как anhydrotetracycline или доксициклин 25. При лиганда дополнение к культуральной среде, TetR теряет сродство к Teto и отделяется от TRE. В результате транскрипции гена-мишени отменена. Экспрессии трансгена могут, таким образом, строго контролироваться в времени и зависимым от дозы образом как в культуре клеток и животных 20,23,24. С TTA, трансгенная экспрессия происходит конститутивно, за исключением того, в присутствии тетрациклина. Это может быть недостатком в исследовании цитотоксических или онкогенных белков, поскольку тетрациклин сначала должен быть удален из системы, перед тем трансгенной expressioп происходит и эффекты белка-мишени на клетке можно контролировать. Это может быть трудоемким и не всегда бывает полным, особенно в трансгенных животных 27. Для решения это ограничение, TetR мутант с обратной ответ на присутствие доксициклина был использован для создания нового фактора транскрипции, rtTA (обратный TTA) 28. Это связывается только с TRE и, одновременно, активирует транскрипцию в присутствии доксициклина. Остаточный неплотности системы, т.е.., Трансген выражение в отсутствии TRE-связанного фактора транскрипции, происходящий либо (I) от эффектов положения в геномной сайта интеграции, (II) от самого TRE 29, или (III) от не -специфический связывающий ТТА / rtTA 28, был адресован введением дополнительного транскрипции глушитель, называют TTS (тетрациклин-зависимой транскрипции глушитель) 30 к системе. Он образует двойную сеть регулятор вместе с rtTA (рисунок 1).При отсутствии доксициклин, ТЦ связывается с TRE и активно выключается оставшуюся транскрипции. В присутствии доксициклина, TTS диссоциирует от TRE и rtTA связывает одновременно индукции экспрессии гена-мишени. Этот дополнительный слой жесткости часто необходимо, чтобы выразить высокоактивные цитотоксические белки 31-34.
Используя этот жестко контролируется система двойного регулятора, апоптическая каскад может быть начато при определенной стадии, позволяющей анализ может ли данный белок эффектор мешать индукции апоптоза. Этот метод не может быть использован только для изучения антиапоптозную активности бактериальных эффекторных белков, но и для индуцируемой экспрессии про-апоптотических или токсичных белков или для рассечения помех других сигнальных путей.
Многие патогенные бактерии гавани секреции систем выделяют или перемещать бактериальных эффекторных белков в клетке-хозяине. Эти эффекторные белки обладают способностью модулировать процессы и пути в клетке-хозяине, что позволяет бактериям выжить и воспроизвести в соответствии с и?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
DMEM | life technologies | 31966-021 | |
FCS | Biochrom | S0115 | |
Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
OptiMEM | life technologies | 51985 | |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
Geneticin | Roth | CP11.3 | |
Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
anti-GFP | life technologies | A6455 | |
anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |