JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Published: June 25, 2015
doi:
10.3791/52903
, , ,
1Department Biologie,Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese,Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut – Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene,Universitätsklinikum Erlangen

Summary

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Abstract

De hier gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om te analyseren welke stap een doeleiwit, of als alternatief een klein molecuul, een interactie aangaat met de componenten van een signaleringsroute. De werkwijze berust enerzijds op de induceerbare expressie van een specifiek eiwit aan een signalering gebeurtenis op een bepaalde en vooraf bepaalde stap in het geselecteerde signaalcascade te initiëren. Gelijktijdige expressie, anderzijds, van het gen van belang dan kan de onderzoeker om te beoordelen of de activiteit van het doeleiwit tot expressie stroomopwaarts of stroomafwaarts ligt van de signalering geïnitieerde gebeurtenis, afhankelijk van het uitlezen van de signaalroute die wordt verkregen. Hier werd de apoptotische cascade geselecteerd als een gedefinieerde signaleringsroute protocol functionaliteit te demonstreren. Pathogenen, zoals Coxiella burnetii, transloceren effector eiwitten die interfereren met menselijke celdood inductie in de gastheercel om bacteriële overleven in de cel en het bevorderen van hunverspreiding in het organisme. De C. burnetii effector eiwit CAEB effectief remt gastheercel dood na inductie van apoptose met UV-licht of met staurosporine. Om een ​​beperking van op welke stap CAEB interfereert met de verspreiding van het apoptotische signaal, werden geselecteerd eiwitten met een goed gekarakteriseerde pro-apoptotische activiteit tijdelijk in een doxycycline-induceerbare manier uitgedrukt. Als CAEB handelingen stroomopwaarts van deze eiwitten apoptose hinder ondervinden. Als CAEB handelt downstream, zal celdood worden geremd. De testeiwitten geselecteerd waren Bax, die optreedt ter hoogte van de mitochondria en caspase 3, dat het belangrijkste uitvoerder protease. CAEB verstoort celdood geïnduceerd door Bax expressie, maar niet caspase 3 expressie. CAEB dus samenwerkt met de apoptotische cascade tussen deze twee eiwitten.

Introduction

De virulentie van vele Gram-negatieve bacteriële pathogenen is afhankelijk van gespecialiseerde secretie systemen om eukaryotische gastheercellen kapen. Bacteriën gebruiken dit secretiesystemen bacteriële virulentie eiwitten (effectoren) in de gastheercel injecteren van verschillende cellulaire en biochemische activiteiten te moduleren. De studie van effector eiwitten heeft niet alleen verstrekt opmerkelijk inzicht in de fundamentele aspecten van gastheer / pathogeen interacties, maar ook in de fundamentele biologie van eukaryote cellen 1. Modulatie van gastheercel apoptose is aangetoond dat een belangrijke virulentie mechanisme voor vele intracellulaire pathogenen en een aantal effector eiwitten moduleren van apoptose geïdentificeerd 2-9. Echter, de precieze moleculaire mechanisme ter blijven ongrijpbaar in veel gevallen.

Apoptose is een vorm van geprogrammeerde celdood, speelt een belangrijke rol bij de immuunrespons op infectie 10. Twee belangrijke routes die leiden tot apoptosegeïdentificeerd: gericht op de mitochondria (intrinsieke apoptose) of directe transductie van het signaal via celdood receptoren in het plasmamembraan (extrinsieke apoptose). De intrinsieke of mitochondriën gemedieerde celdood wordt veroorzaakt door intracellulaire signalen en omvat de activering van Bax en Bak, twee pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie. Deze familie is samengesteld uit pro- en anti-apoptotische regulator eiwitten die celdood 11-14 regelen. Activering van apoptose leidt tot oligomerisatie van Bax en Bak gevolgd door achtereenvolgende permeabilisatie van het mitochondriale buitenste membraan, waardoor cytochroom C introductie in het cytoplasma. Cytochroom C afgifte initieert activering van de effector caspasen 3 en 7 tot activatie van caspase 9 in de apoptosoom 15. Dit leidt tot proteolyse van geselecteerde substraten die onder andere resulteert in de blootstelling van fosfatidylserine aan het celoppervlak 16 en maakt een speciaal DNase die ch fragmentenromatin 17,18.

Om te bepalen waar in de apoptotische cascade individuele effector eiwit interfereert, een induceerbaar expressiesysteem werd toegepast 19. Regulerende systemen voor voorwaardelijke expressie van transgenen hebben een waardevol hulpmiddel bij het ​​analyseren van de functie van een eiwit in de cel of het belang ervan voor weefsel, orgaan en organisme ontwikkeling, evenals tijdens initiatie, progressie en het onderhoud van de ziekte 20-23 geweest. Gewoonlijk induceerbare systemen, zoals het Tet-systeem 24 hier toegepast, vormen een kunstmatige transcriptie-eenheid (zie figuur 1). Eén component is een kunstmatig ontwikkelde transcriptiefactor genaamd tTA (tetracycline-afhankelijke transcriptie activator), gevormd door fusie van de bacteriële transcriptie-repressor TetR 25 aan een zoogdierpatiënt eiwitdomein die transcriptionele activatie of silencing 24,26 bemiddelt. De tweede component is een hybridepromoter, aangeduid als TRE (tetracycline-responsief element), bestaande uit een eukaryotische minimale promoter, die ten minste een TATA-box en een transcriptie-initiatieplaats, verbonden met meerdere herhalingen van de cognate-DNA bindingsplaats voor TetR, tetO 24,25. De derde component is het natuurlijke ligand van TetR, tetracycline of een van zijn derivaten, zoals anhydrotetracycline en doxycycline 25. Na ligand toevoeging aan het kweekmedium, TetR verliest zijn affiniteit voor tetO en dissocieert van het TRE. Daardoor wordt transcriptie van het doelgen opgeheven. Transgene expressie kan derhalve worden strak gecontroleerd in een tijds- en dosisafhankelijke manier in zowel celkweek als bij dieren 20,23,24. Met tTA, transgenexpressie treedt constitutief, behalve bij aanwezigheid van een tetracycline. Dit kan een nadeel in de studie van cytotoxische of oncogene eiwitten omdat tetracycline moet eerst uit het systeem worden verwijderd, voordat transgene expression optreedt en het doeleiwit effecten op de cel kan worden gecontroleerd. Dit kan tijdrovend en niet altijd volledig, vooral in transgene dieren 27. Om deze beperking te pakken, een TetR mutant met een inverse reactie op de aanwezigheid van doxycycline werd gebruikt om een nieuwe transcriptiefactor genereren rtTA (reverse tTA) 28. Het bindt alleen aan de TRE en, tegelijkertijd, transcriptie activeert in aanwezigheid van doxycycline. Residuele lekkages van het systeem, dwz., Transgene expressie in de afwezigheid van TRE-gebonden transcriptiefactor, van hetzij (i) van positie-effecten op genomische integratieplaats, (ii) vanaf het TRE 29 zelf, of (iii) uit niet -specifieke binding van tTA / rtTA 28, werd door de opneming van een extra transcriptiesilencerdomein, genaamd TTS (tetracycline-afhankelijke transcriptionele geluiddemper) 30 aan het systeem. Het vormt een dubbele regulator vergeaeld rtTA (zie figuur 1).Bij afwezigheid van doxycycline, tts bindt aan TRE en actief wordt uitgeschakeld resterende transcriptie. In de aanwezigheid van doxycycline, tts dissocieert van TRE en rtTA bindt gelijktijdig induceren van expressie van het doelwitgen. Deze extra laag stringentie moet vaak zeer actieve cytotoxische eiwitten 31-34 expressie.

Met deze strak dual-regulator systeem kan de apoptotische cascade bij een bepaalde stap waarbij wordt onderzocht of de gegeven effector eiwit kunnen interfereren met apoptose-inductie worden gestart. Deze werkwijze kan niet alleen worden gebruikt om de anti-apoptotische activiteit van bacteriële effector eiwitten te bestuderen, maar ook voor de induceerbare expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten of ontleden interferentie met andere signaalwegen.

Protocol

1. Het genereren van stabiele cellijnen die het beoogde eiwit Bereid media door het toevoegen van warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline / streptomycine commercieel verkrijgbaar Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met GlutaMAX-I, pyruvaat, en 4,5 g / l D-glucose. Ontwikkel HEK293 cellen in medium bij 37 ° C in 5% CO 2. Sub-kweken cellen elke derde dag. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 15 ml vers medium. Pipetteer 1 ml in een nieuwe 75 cm 2</su…

Representative Results

Ten eerste, HEK293-cellijnen die stabiel het eiwit van belang (CAEB) als GFP-fusie-eiwit werden vastgesteld. Als controle werden HEK293-cellijnen die stabiel GFP ook gegenereerd. Expressie van GFP en GFP-CAEB werd gecontroleerd door immunoblot analyse. De representatieve immunoblot (Figuur 4A) toont stabiele en duidelijk detecteerbare expressie van GFP en GFP-CAEB. Echter, deze test niet bepalen of alle cellen tot expressie GFP of GFP-CAEB. Daarom werden de stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen gean…

Discussion

Vele pathogene bacteriën herbergen secretiesystemen afscheiden of translocatie van bacteriële effector eiwitten in de gastheercel. Deze effector eiwitten hebben het vermogen om processen en cascades in de gastheercel, waardoor de bacteriën om te overleven en repliceren hun intracellulaire niche. Inzicht in de biochemische activiteiten en de moleculaire mechanismen van de effector eiwitten zal helpen naar een beter begrip van de pathogeniteit en kunnen helpen om nieuwe therapeutische instrumenten voor de bestrijding v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

Materials

DMEM life technologies 31966-021
FCS Biochrom S0115
Pen/Strep life technologies 15140-122
OptiMEM life technologies 51985
X-tremeGENE 9 Roche 6365752001
Geneticin Roth CP11.3
Polyethylenimine Polyscienes 23966
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26616
PVDF membrane Millipore IPVH00010
anti-GFP  life technologies A6455
anti-cleaved PARP BD Bioscience 611038
anti-actin Sigma Aldrich A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO Dianova 111-035-045
ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46428
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Tags

Inducible Expression SystemBacterial Virulence FactorsIntracellular SignalingApoptotic CascadeCoxiella BurnetiiCaeB Effector ProteinBaxCaspase 3Cell DeathSignaling PathwayProtein Interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Berens, C., Bisle, S., Klingenbeck, L., Lührmann, A. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (100), e52903, doi:10.3791/52903 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image