母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

妊娠中の免疫寛容は、母親の免疫系が発達中の胎児を受け入れ、育成するために、特徴的な変化を受けることが必要です。この公差は、性交中に開始受精および注入中に設立され、妊娠中を通して維持されています。母体·胎児の寛容の活性細胞および分子メディエーターは、胎盤と子宮と脱落膜組織を含む母体胎児のインターフェイスとして知られている胎児と母体組織との接触部位に濃縮されています。このインタフェースは、間質細胞および浸潤白血球で構成され、その豊かさと表現型の特徴は、妊娠の経過とともに変化します。母体胎児のインターフェイスにおける浸潤白血球は、一緒に妊娠を維持局所微小環境を作成し、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、T細胞、B細胞、NK細胞およびNKT細胞を含みます。これらの細胞間の不均衡、または任意inappropそれらの表現型でriate変化は、妊娠中の病気のメカニズムと考えられています。したがって、母体胎児のインターフェイスに侵入白血球の研究は、妊娠関連の合併症を引き起こす免疫機構を解明するために不可欠です。本明細書に記載の母体胎児の界面でのマウス組織から浸潤白血球を分離するために、タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素カクテルと強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用するプロトコルです。このプロトコルは、十分に保存された抗原性および機能的特性を有する生存可能な白血球（> 70％）の高い数の分離を可能にします。単離された白血球は、その後、免疫表現型、細胞選別、イメージング、免疫ブロット法、mRNA発現、細胞培養物、およびこのような混合白血球反応、細胞増殖、または細胞傷害性アッセイなどのインビトロの機能的アッセイを含むいくつかの技術によって分析することができます。

Introduction

妊娠中の免疫寛容は、独特の変化が母親の免疫システム内で発生する期間です。これらの変更は、母親が胎児、半同種移植片^1を許容することができます。胎児が父親の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）は²抗原発現、および胎児細胞が母体循環³において見出されています。しかし、胎児は^4,5を拒否されていません。この謎は完全には理解されていません。

最新の仮説は、母体·胎児寛容は性交と受精^6,7中に作成され、満期妊娠^8-10を維持するために維持されていることを述べています。この母体·胎児寛容の内訳は、妊娠^10〜16の初期および後期の段階で病気のメカニズムを考えられています。母体胎児の耐性は、Mac、T細胞（調節性T細胞、Th1細胞、Th2細胞、およびTh17細胞）を含む様々な白血球サブ集団の参加を含みますrophages、好中球、マスト細胞、NK細胞、及びNKT細胞、樹状細胞、及びB細胞、妊娠^15,17-19を通して密度および局在のその変化。母親の免疫系が胎児性抗原^20,21と相互作用する解剖学的部位-母体·胎児許容範囲は、母体·胎児の界面²⁰で濃縮されています。

胎児の絨毛外栄養膜細胞が子宮粘膜^22-24に侵入^したときに母体胎児のインターフェイスは、胎盤形成中に作成されています。このインタフェースの胎児側には、胎児の周囲の膜は、胎盤内で特殊な上皮表面を作成し、合胞体栄養細胞が母体血²²との直接接触を介して栄養交換を制御します。インターフェイスの母体側では、脱落膜は、マウスですべての脱落膜細胞の50％〜30％を占めて白血球の異種のプールを募集しています。 maternへの参加に加えて、アル免疫寛容、これらの細胞は、妊娠中の異なるプロセス、 例えば 、感染症、受精から生殖器官の保護、胚移植の^7,25、脱落膜血管新生^26、血管リモデリング^24,27、栄養膜浸潤^28、胎盤に重要な貢献者であります開発^24,25、および、最終的には、分娩^15,17。したがって、母体·胎児寛容に関与する白血球の研究は、妊娠関連の合併症の病因を解明するために不可欠です。

免疫組織化学および免疫蛍光法の使用は、直接可視化および子宮、脱落膜、または胎盤白血球^29,30のローカリゼーションのためのデータを生成しているが、さらに、これらの組織^31,32のそれぞれに白血球の特定のサブセットを明らかにしたフローサイトメトリー分析。さらに、フローサイトメトリー母校の密度および割合を決定するために使用されていますNAL-胎児のインターフェイス白血球³³と外および細胞内タンパク質^8-10,34の発現レベル。母体胎児の界面での白血球のフローサイトメトリー分析は、単一細胞懸濁液を必要とします。脱落膜、子宮、胎盤組織から浸潤白血球を単離するために、組織解離の二つの方法が使用されてきた：機械的および酵素。両方の方法は、これらの組織の細胞外マトリックス（ECM）の浸潤白血球の分離を可能にします。それはより少ないせん断力関連の損傷³⁵と白血球のより高い収率を可能にするような酵素組織解離は、機械的組織解離よりも優れています。その結果、機械的な組織解離は、サンプルの変動性と不均一性を高めることができるプールの組織^36を必要とします。しかし、機械的解離は、目的の抗原を酵素的解離または時によって変更することができるときに選択することができる細胞の機能興味のあるのは、（ 例えば 、NK細胞の細胞傷害性）を保持する必要がある^35。

ECMを分解する特定の酵素を用いたタンパク質分解の使用は、機械的解離で観察された低い収率を排除します。いくつかの研究は^{、37 32}コラゲナーゼ、トリプシンの使用を報告している、DNアーゼ^31は、38ディスパーゼ、および種々の酵素^32,39の商業カクテル。しかし、自然と異なる酵素の濃度と消化の期間は、細心の注意を払って定義され、免疫表現するために必要な細胞表面抗原エピトープの完全性の維持を確実にするために検証する必要があります。さまざまな表面構造は、多数のモノクローナル抗体によって認識される白血球の表面エピトープを除去するための悪名高いされ、トリプシンなどのいくつかの酵素を用いて、異なる酵素による破壊に差次受けやすいです。

本明細書の導入proteolytを用いる方法でありますICおよびコラーゲン分解酵素カクテルは、のAccutaseと呼ばれます。この酵素溶液は、母体胎児の界面でのマウス組織を解離まだ効率的ながら十分に穏やかであり、解離反応を停止し、他の解離試薬または血清の添加を必要としません。また、解離の時間を検証する必要があるが、それは上記の酵素^40,41よりも堅牢で、供給として使用する準備ができていると。

組織の脱凝集の両方のタイプの組合せの利用は、得られた細胞の質および量を改善します。このように、いくつかの研究は、満足のいく結果^31,32,37に機械的および酵素的解離の併用を実装しています。本明細書に記載されるプロトコルが確立され、我々の研究室で確認されました。それは強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用しています。このプロトコルは、の単離およびさらなる研究を可能にします母体·胎児の界面でのマウス組織における浸潤白血球（子宮、脱落膜、および胎盤）。フローサイトメトリー分析によって示されるように、以下のプロトコルは、細胞表面マーカー及び収率下流アプリケーションのための十分な生存可能な細胞の完全性を維持します。最後に、このプロトコルは、母体·胎児のインターフェイスを構成する種々のマウス組織の分析と比較のための細胞調製物の整合性を維持します。

Protocol

このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、動物の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査委員会によって与えられなければなりません。このプロトコルで述べたように、動物の血液、細胞、または危険な薬剤で作業している場合は、適切なバイオセーフティと実験室の安全行動に従わなければなりません。 1.マウスの取扱い及び組織収集<…

Representative Results

母体·胎児のインターフェイスからのマウスの組織の切開は、 図1に示されています。この手順は、移植部位（ 図1D）を含む、腹腔（ 図1A、B）、子宮角（ 図1C）を開くと、子宮組織の集合（ 図1E）、胎盤（ 図1F）、および脱落膜組織16.5で（ 図1G）が DPC。 図2は、単離されたマクロファージの…

Discussion

母体·胎児の界面に浸潤白血球の豊かさと表現型の特徴を記録する一貫性のあるデータの収集は、妊娠関連の合併症の病因を理解するために不可欠です。いくつかの技術は、妊娠^{31,38,39,43-46}を通して母体胎児の界面でのマウス組織からの白血球浸潤の単離を容易にすることが記載されています。しかし、それぞれの技術は、異なる別の酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを?…

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope