Summary

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Immuuntolerantie in de zwangerschap vereist dat het immuunsysteem van de moeder ondergaat opvallende veranderingen om te accepteren en te koesteren de zich ontwikkelende foetus. Deze tolerantie wordt gestart tijdens de coïtus, tijdens bevruchting en implantatie opgericht en onderhouden tijdens de zwangerschap. Actieve cellulaire en moleculaire mediatoren van tolerantie maternale-foetale worden verrijkt op de plaats van contact tussen foetale en maternale weefsels, zogenaamde maternale-foetale interface, die de placenta en de baarmoeder en deciduale weefsel omvat. Deze interface omvat stromale cellen en infiltrerende leukocyten en hun overvloed en fenotypische karakteristieken verandert in de loop van de zwangerschap. Infiltrerende leukocyten in het maternale-foetale-interface omvatten neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen, mestcellen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en NKT cellen die tezamen de lokale micro-omgeving die de zwangerschap in stand te creëren. Een onbalans tussen deze cellen of inappropriate verandering in hun fenotypen wordt beschouwd als een mechanisme van ziekte tijdens de zwangerschap. Daarom is de studie van leukocyten dat de maternale-foetale-interface infiltreren is essentieel om de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap verwante complicaties helderen. Hierin beschreven is een protocol dat een combinatie van zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische disaggregatie met een proteolytische en collagenolytische enzymatische cocktail de infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels te isoleren van de maternale-foetale interface gebruikt. Dit protocol maakt de isolatie van grote aantallen levensvatbare leukocyten (> 70%) met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen. Geïsoleerde leukocyten kan vervolgens worden geanalyseerd door verscheidene technieken, waaronder immunofenotypering, celsortering, imaging, immunoblotting, mRNA expressie, celkweek en in vitro functionele testen zoals gemengde leukocyt reacties, proliferatie of cytotoxiciteit assays.

Introduction

Immunotolerantie bij zwangerschap is een periode waarin kenmerkende reactie plaatsvinden het immuunsysteem van de moeder. Deze veranderingen kan de moeder naar de foetus, een semi-allogeen transplantaat 1 tolereren. De foetus tot expressie vaderlijke major histocompatibility complex (MHC) antigenen 2 en foetale cellen gevonden in de moederlijke circulatie 3; echter de foetus niet verworpen 4,5. Dit raadsel is niet helemaal duidelijk.

De meest recente hypothese stelt dat de moeder-foetale tolerantie wordt gemaakt tijdens de coïtus en bevruchting 6,7 en onderhouden om een voldragen zwangerschap 8-10 ondersteunen. Een uitsplitsing van deze moeder-foetale tolerantie wordt beschouwd als een mechanisme van de ziekte tijdens de vroege en late stadia van de zwangerschap 10-16. Maternale-foetale tolerantie betreft de deelname van diverse leukocyten subpopulaties, waaronder T-cellen (regulatoire T-cellen, Th1-cellen, Th2-cellen, en Th17 cellen), macrophages, neutrofielen, mastcellen, NK-cellen en NKT-cellen, dendritische cellen en B-cellen, die verandering in dichtheid en lokalisatie gedurende de zwangerschap 15,17-19. Maternale-foetale tolerantie verrijkt ten maternale-foetale-interface 20 – de anatomische plaats waar het immuunsysteem van de moeder interageert met de foetale antigenen 20,21.

De moeder-foetale interface is gemaakt tijdens placentatie wanneer de foetale extravilleuze trofoblastcellen binnenvallen de baarmoeder slijmvlies 22-24. Aan de foetale kant van deze interface, de vliezen rond de foetus het creëren van een gespecialiseerde epitheeloppervlak binnen de placenta en de syncytiotrofoblast cellen controle van de uitwisseling van voedingsstoffen via hun direct contact met bloed van de moeder 22. Aan moederszijde van de interface, de decidua rekruteert heterogene pool van leukocyten in muizen die verantwoordelijk zijn voor 30% tot 50% van alle decidua cellen. Naast hun deelname aan Maternal immuun tolerantie, deze cellen zijn de belangrijkste bijdragers aan verschillende processen tijdens de zwangerschap, bijv., de bescherming van de voortplantingsorganen van infecties, bevruchting, embryo implantatie 7,25, deciduale angiogenese 26, vasculaire remodeling 24,27, trofoblastinvasie 28, placenta ontwikkeling 24,25, en, uiteindelijk, arbeid en levering 15,17. Daarom is het onderzoek van de bij maternale-foetale tolerantie leukocyten is essentieel voor het ophelderen van de pathogenese van zwangerschap gerelateerde complicaties.

Hoewel het gebruik van immunohistochemie en immunofluorescentie gegevens heeft gegenereerd voor de directe visualisatie en lokalisatie van baarmoeder, decidua of placenta leukocyten 29,30 flowcytometrie analyse bleek voorts specifieke subsets van leukocyten in elk van deze weefsels 31,32. Daarnaast flowcytometrie is gebruikt om de dichtheid en percentage mater vastnal-foetale-interface leukocyten 33 en expressie van extracellulaire en intracellulaire eiwitten 8-10,34. Flow cytometrische analyse van leukocyten bij de moeder-foetale-interface vereist een single-cell suspensie. Om infiltrerende leukocyten te isoleren van de deciduale, baarmoeder, placenta en weefsels zijn twee methoden weefsel dissociatie gebruikt: mechanische en enzymatische. Beide werkwijzen maken de scheiding van geïnfiltreerde leukocyten uit de extracellulaire matrix (ECM) van deze weefsels. Enzymatische weefsel dissociatie is superieur aan mechanische weefsel dissociatie omdat het zorgt voor een hogere opbrengst van leukocyten met minder shear-force-bijbehorende schade 35. Bijgevolg mechanische weefsel dissociatie vraagt ​​erom weefsel 36, waarbij de variabiliteit en heterogeniteit van de monsters kan toenemen. Toch kan mechanische dissociatie de keuze bij het antigeen van belang kan worden veranderd door enzymatische dissociatie of wanneer de functionaliteit van de cels plaats moeten worden behouden (bijv., cytotoxiciteit van NK-cellen) 35.

De toepassing van proteolyse van specifieke enzymen om de ECM breken elimineert de lage opbrengsten waargenomen met mechanische dissociatie. Verschillende studies hebben melding gemaakt van het gebruik van trypsine 32, collagenase 37, DNase 31, dispase 38 en commerciële cocktails van verschillende enzymen 32,39. Echter, de aard en concentratie van de verschillende enzymen en de duur van digestie nauwkeurig worden vastgesteld en gevalideerd om handhaving van de integriteit van het celoppervlak antigene epitopen vereist voor immunofenotypering waarborgen. De verschillende oppervlaktestructuren zijn differentieel gevoelig voor vernietiging door verschillende enzymen, met sommige enzymen, zoals trypsine, die bekend voor het strippen van leukocyten oppervlakte epitopen herkend door verschillende monoklonale antilichamen.

Hierin wordt geïntroduceerd is een methode waarbij een proteolytic en collagenolytische enzymatische cocktail, genaamd Accutase. Deze enzymatische oplossing is mild genoeg terwijl efficiënt dissociëren murine weefsels bij de maternale-foetale interface en vereist geen toevoeging van andere dissocieert reagentia of serum dat zij de dissociatie reactie te beëindigen. Bovendien is het klaar voor gebruik en behoeft, hoewel de tijd van dissociatie moet worden bevestigd, is robuuster dan de bovengenoemde enzymen 40,41.

Het gebruik van een combinatie van beide soorten weefsel disaggregatie verbetert de kwaliteit en de hoeveelheid cellen verkregen; aldus, hebben verschillende studies het gecombineerde gebruik van mechanische en enzymatische dissociatie uitgevoerd met bevredigende resultaten 31,32,37. De hierin beschreven protocol werd vastgesteld en gevalideerd in ons laboratorium; Het gebruikt een combinatie van een zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische uitsplitsing. Dit protocol maakt de isolatie en verdere studiede infiltrerende leukocyten in muizen weefsels bij de maternale-foetale interface (uterus, decidua en placenta). Het volgende protocol handhaaft de integriteit van celoppervlak markers en levert voldoende levensvatbare cellen voor verdere toepassingen zoals aangetoond door flow cytometrische analyse. Ten slotte is dit protocol handhaaft de samenhang van celpreparaat voor de analyse en vergelijking van verschillende murine weefsels van het maternale-foetale interface.

Protocol

Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet dier ethische goedkeuring worden gegeven door de lokale Research Ethics Committee en de Institutional Review Boards. Bij het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlijke stoffen als bedoeld in dit protocol, moet de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd. 1. Mouse Handling en Tissue Collection Bereid een steriele werkplek en het verkrijgen van steriele instrumenten voor het weefsel …

Representative Results

De dissectie van muizen weefsels van de maternale-foetale interface is weergegeven in figuur 1; Deze procedure omvat het openen van de peritoneale holte (Figuur 1A, B), baarmoederhoorns (figuur 1C) met de implantatieplaatsen (figuur 1D), en het verzamelen van de baarmoederweefsels (Figuur 1E), placenta (Figuur 1F), en decidua weefsels (figuur 1G) en 16,5 dpc. Figuur 2 toont de morfologi…

Discussion

Het verzamelen van consistente gegevens die de overvloed en fenotypische kenmerken van het infiltreren leukocyten registreert bij de moeder-foetale interface is van essentieel belang voor het begrijpen van de pathogenese van de zwangerschap gerelateerde complicaties. Verschillende technieken beschreven dat de isolatie van infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels bij maternale-foetale-interface gedurende de zwangerschap 31,38,39,43-46 vergemakkelijken. Echter, elke techniek verschilt, gebruikt verschill…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NGL werd gesteund door de Wayne State University Perinatale Initiative in Maternal, Perinatale en Child Health. We dankbaar erkennen Maureen McGerty en Amy E. Comfort Suites Comfort Suites (Wayne State University) voor hun kritische lezing van het manuscript.

Materials

Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies (Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin (BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother’s little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system’s interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring’s health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Play Video

Cite This Article
Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

View Video