Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l'identificazione automatizzata e l'analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.
Invasione e la colonizzazione delle cellule ospiti di batteri patogeni dipendono dall'attività di un gran numero di proteine procariotiche, definite come fattori di virulenza, che può sovvertire e manipolare funzioni host chiave. Lo studio delle interazioni ospite / patogeno è quindi estremamente importante per comprendere le infezioni batteriche e di sviluppare strategie alternative per combattere le malattie infettive. Questo approccio tuttavia, richiede lo sviluppo di nuovi saggi high throughput per la imparziale, l'identificazione automatica e la caratterizzazione dei determinanti di virulenza batterica. Qui, si descrive un metodo per la generazione di una libreria mutante GFP-tagged by trasposone mutagenesi e lo sviluppo di screening ad alto contenuto di approcci per l'identificazione simultanea di più fenotipi trasposoni-associata. Il nostro modello di lavoro è intracellulare batterica burnetii patogeno Coxiella, l'agente eziologico della febbre zoonosi Q, che è associato con sévere epidemie con un conseguente onere sanitario e economico. La natura obbligato intracellulare di questo patogeno è, fino a poco tempo, gravemente ostacolato l'identificazione dei fattori batterici coinvolti nella patogeno ospite, rendendo di Coxiella il modello ideale per l'attuazione di approcci high-throughput / alto contenuto.
L'emergente, batterio endemico Coxiella burnetii è responsabile di grandi epidemie di febbre Q, una debilitante zoonosi simil-influenzale con grave salute e l'impatto economico 1. I principali serbatoi di Coxiella sono animali domestici e da fattoria, e si stima che oltre il 90% dei bovini da latte negli Stati Uniti portano C. burnetii 2. Gli esseri umani sono ospiti accidentali che vengono infettati da inalazione di aerosol contaminati. Febbre Q umana si manifesta sia come una malattia acuta o cronica, che può avere complicanze fatali, con un tasso di mortalità raggiunge il 65% 1,3. Con una dose infettiva di 1 – 10 organismi, Coxiella è il patogeno più infettiva noto ed è stato studiato come potenziale arma bio 4. La recente epidemia esplosiva di febbre Q nei Paesi Bassi (2007 – 2010), con casi crescente da 182 a più di 2.000 all'anno, si pone come un esempio della grave virulenza di questo patogeno5.
La notevole efficienza di infezioni Coxiella è probabilmente associata con la sua resistenza allo stress ambientale, in combinazione con il suo adattamento unico di ospitare le cellule. Infatti, Coxiella è presente nell'ambiente sotto forma di varianti metabolicamente inattive a piccole cellule (SCV), che sono notevolmente resistenti alle diverse condizioni difficili (essiccamento, temperatura, etc.). Distributori sono up presa da fagociti via α V β 3 integrine 6 mentre l'invasione delle cellule non fagocitiche è mediato dal Coxiella adesione / invasione OmpA 7 e un recettore non ancora identificato. Dopo l'assorbimento, Coxiella risiede in vacuoli aderenti, positivi per i marcatori endosomali primi Rab5 e EEA1 8. I batteri rispondono a endosomiale acidificazione convertendo alle varianti a grandi cellule metabolicamente attive (LCV) e l'attivazione di un sistema di secrezione di tipo 4 Dot / Icm (T4SS) 9, Altamente omologa a quella di Legionella pneumophila 10. La secrezione di effettori Dot / ICM consente coxiella di generare un grande vano acido LAMP1-positivo contenente enzimi lisosomiali attivi dove i batteri possono prosperare e attivamente proteggere le cellule infette da apoptosi 11. Pertanto, il ciclo di intracellulare Coxiella è controllata dalla traslocazione Dot / Icm-mediata di effettori batterici 12, tuttavia, i fattori microbici coinvolti nell'invasione cellula ospite, replicazione batterica e la diffusione dell'infezione sono generalmente poco noti.
La combinazione di trasposoni mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza, stiamo sviluppando approcci imparziali per l'identificazione simultanea di fattori batterici coinvolti nelle fasi principali di infezioni Coxiella: 1) internalizzazione all'interno delle cellule ospiti, 2) la replica intracellulare, 3) spread cella-a-cella e 4) la persistenza. Fino ad oggi, abbiamo proiettato oltre 1.000 mutations in 500 sequenze Coxiella codificanti, che ci ha fornito intuizioni senza precedenti nelle interazioni ospite-patogeno che regolano Coxiella patogenesi 7. Da notare, questo approccio può essere applicato allo studio di altri patogeni intracellulari che condividono caratteristiche di biologia cellulare con Coxiella.
Lo studio delle interazioni ospite / patogeno ha dimostrato di essere un metodo notevole per capire infezioni batteriche e sviluppare strategie alternative per contrastare malattie infettive. Tuttavia, a causa della diversità delle strategie elaborate da diversi batteri patogeni, l'identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza batterici e dell'ospite vie di segnalazione che sono indirizzate durante le infezioni rappresentano una vera e propria sfida. Ciò richiede lo sviluppo di nuovi approcci per l'identificazione su larga scala dei nodi principali di interazione ospite / patogeno. Il recente sviluppo di prodotti innovativi, ad alto throughput e tecniche di screening ad alto contenuto rappresenta una preziosa risorsa che può essere adattato allo studio di batteri patogeni intracellulari 15. Qui, abbiamo usato il zoonotici batterica patogeno coxiella burnetii come modello per sviluppare approcci di screening che combinano transposon mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza. Importantemente, questo metodo di screening consente il monitoraggio simultaneo di molteplici fasi del ciclo intracellulare Coxiella, fornendo una panoramica globale delle strategie sviluppate da questo batterio di invadere, replicare e persistono all'interno delle cellule infette.
L'approccio qui descritto si basa su due tecniche ben consolidate, trasposone mutagenesi e saggi basati sulla fluorescenza, che sono state applicate con successo allo studio di batteri patogeni. Combinando queste tecniche nel contesto di schermi ad alta produttività / elevato contenuto permette di valutare gli effetti di un elevato numero di mutazioni batteriche analizzando un numero molto elevato di eventi (tipicamente 15.000 cellule infettate per mutazioni batteriche vengono esposte e analizzati). Ciò fornisce un importante analisi statistica di eventi come invasione batterica delle cellule ospiti e la replica intracellulare, che sono, per natura, ad una elevata variabilità. È importante notare che le linee cellulari diverse epithelial può essere utilizzato per questo tipo di screening. Tuttavia, le cellule epiteliali piatte e grandi sono ottimali per l'analisi delle immagini come organelli delle cellule ospiti sono più facili da individuare. Poiché la maggior parte dei microscopi automatici può gestire automaticamente un gran numero di piatti, non ci sono limiti al numero di mutanti che possono essere proiettati contemporaneamente. A seconda del patogeno, il privilegio utente può l'uso di un epifluorescenza o un microscopio confocale. Il tempo di acquisizione dell'immagine sarà principalmente dipende dalla sensibilità della telecamera microscopio, il numero di campi acquisiti per pozzetto e dal numero di canali acquisiti per campo di vista. L'utente può decidere come regolare questi fattori per ottimizzare il protocollo di screening. A titolo di esempio, abbiamo ripreso una 96-pozzetti / h utilizzando le condizioni di cui al punto 5.1. L'analisi delle immagini dipende in gran parte la macchina (o cluster di macchine) utilizzato. Usiamo un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB di RAM workstation. La macchina richiede approxirca 40 minuti per analizzare le immagini acquisite da una piastra.
Un aspetto importante da prendere in considerazione nella preparazione di queste analisi è la messa a punto di nuovi (o l'ottimizzazione di protocolli esistenti) per consentire la manipolazione e il trattamento di un gran numero di campioni. Un esempio tipico è lo sviluppo della singola colonia di primer PCR approccio, che ha permesso di amplificare rapidamente e frammenti di sequenza di DNA contenenti Coxiella il sito di inserimento di ciascun trasposone, da campioni molto piccoli. Sulla base della nostra esperienza, la polimerasi ad alta fedeltà deve essere attentamente selezionati e testati per ottenere risultati riproducibili. L'unica limitazione di questo approccio può nascondere nell'osservazione che, nella maggior parte dei casi, circa il 30% dei campioni trattati non sono sfruttabili, sia a causa della PCR o la procedura di sequenziamento. Tuttavia, considerando che l'isolamento di nuovi mutanti di trasposoni Coxiella non è un fattore limitante, questo non rappreinviato un grosso problema. Analogamente, lo sviluppo di un test affidabile per quantificare la concentrazione batterica delle scorte mutanti è stato fondamentale per questo approccio. A causa della tendenza ad aggregarsi Coxiella quando in sospensione, l'uso di letture di densità ottica non è applicabile per calcolare la concentrazione di culture Coxiella e l'unica alternativa esistente era PCR quantitativa (qPCR). Qui, l'uso di un DNA agente intercalante fluorescente contrassegnati notevolmente accelerato batteri quantificazione.
Questo approccio può anche sfruttare l'uso di linee cellulari stabili esprimenti marcatori fluorescenti per diversi compartimenti intracellulari seconda patogeno utilizzato. Un altro aspetto importante è l'uso di colture cellulari privo di rosso fenolo. Abbiamo osservato che questo indicatore pH ha una fluorescenza naturale attraversa spettro rosso e verde che satura il segnale registrato sul lettore di fluorescenza automatizzato.
Tegli strategia qui presentata si basa su casuale mutagenesi trasposoni. Per i mutanti di interesse, si consiglia di convalidare trasposizioni unici (e clonalità) con Southern blot e PCR amplificazioni del sito di inserimento trasposoni.
Oltre al materiale descritto nella sezione protocollo, squadre interessate a utilizzare l'approccio di screening qui presentato, avranno grande vantaggio nel set up di un database relazionale per la raccolta dati, un server per la memorizzazione dei dati e di una stazione di lavoro per l'analisi delle immagini rapida.
È importante sottolineare che il metodo qui descritto è adatto per lo studio di altri patogeni batterici intracellulari fornito un metodo di mutagenesi casuale esiste per il patogeno, linee cellulari possono essere infettati dal patogeno e questo mostra un fenotipo specifico durante l'infezione.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |