burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.
פלישה והתישבות של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים תלויה בפעילות של מספר רב של חלבוני פרוקריוטים, שהוגדר כגורמים ארסי, שיכול לערער ולשנות פונקציות מארח מפתח. המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן לכן חשוב מאוד להבין זיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. גישה זו לעומת זאת, דורשת הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה החדשים לזיהוי משוחד, אוטומטי והאפיון של גורמי אלימות חיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ספריית מוטציה מתויג GFP ידי mutagenesis transposon ופיתוח גבוה הקרנת תוכן גישות לזיהוי בו זמני של פנוטיפים הקשורים transposon מרובים. מודל העבודה שלנו הוא burnetii תאית חיידקי Coxiella הפתוגן, סוכן etiological של קדחת Q zoonosis, אשר מזוהה עם seVere התפרצויות עם בריאות כתוצאה מכך וניטל כלכלי. הטבע תאיים לחייב של הפתוגן זה, עד לאחרונה, הקשה מאוד על זיהוי של גורמי חיידקים מעורבים באינטראקציות הפתוגן מארח, מה שהופך את של Coxiella המודל האידיאלי ליישום תפוקה גבוהה / גבוה תוכן גישות.
החיידק מתעוררים, אנדמי Coxiella burnetii אחראי להתפרצויות גדולות של קדחת Q, zoonosis דמוית שפעת מתישה עם בריאות חמורה והשפעה כלכלית 1. המאגרים העיקריים של Coxiella הם חיות בית ומשק, וההערכה היא כי יותר מ -90% מבקר לחלב בארה"ב לשאת ג burnetii 2. בני אדם הם מארחים מקריים שנגועים על ידי שאיפה של אירוסולים מזוהמים. קדחת Q האנושית באה לידי ביטוי גם כמחלה אקוטית או כרונית, שעשויה להיות לי סיבוכים קטלניים עם שיעור תמותה מגיע 65% 1,3. עם מינון זיהומיות של 1 – 10 אורגניזמים, Coxiella הוא הפתוגן זיהומיות הידועים ביותר והוא נחקר כנשק ביו פוטנציאל 4. ההתפרצות האחרונה הנפץ של קדחת Q בהולנד (2007 – 2010), במקרי הסלמה מ-182 ליותר מ 2,000 בשנה, עומדת כדוגמא לאלימות הקשה של הפתוגן5.
היעילות המדהימה של זיהומי Coxiella הוא צפוי הקשורים להתנגדותה ללחץ סביבתי, בשילוב עם ההתאמה הייחודית שלה לארח תאים. ואכן, Coxiella נמצא בסביבה בצורה של גרסאות מטבולית פעילה קטנות תא (SCV), אשר להפליא עמידים במספר תנאים קשים (התייבשות, טמפרטורה, וכו '). SCVs נתפס על ידי תאי phagocytic באמצעות V α β 3 integrins 6 תוך פלישה של תאים שאינם phagocytic מתווכת על ידי ההדבקה / פלישת Coxiella 7 OmpA וקולט עדיין לא מזוהה. בעקבות ספיגה, Coxiella מתגורר בvacuoles ההדוק, חיובי לסמני endosomal המוקדמים Rab5 וEEA1 8. חיידקים להגיב להחמצת endosomal ידי המרה לגרסות מטבולית פעילה גדולות תא (LCVs) והפעלת מערכת דוט / ICM סוג 4 הפרשה (T4SS) 9, הומולוגי מאוד לזה של Legionella pneumophila 10. הפרשת effectors דוט / ICM תאפשר Coxiella ליצור תא גדול, LAMP1 חיובי חומצי המכיל אנזימי lysosomal פעילים בי חיידקים יכולים לשגשג ופעיל בהגנה על תאים נגועים מאפופטוזיס 11. לפיכך, המחזור תאיים של Coxiella נשלט על ידי טרנסלוקציה תיווך ICM דוט / של effectors חיידקי 12, לעומת זאת, גורמי החיידקים מעורבים בפלישת מארח תא, שכפול והפצה של חיידקי הזיהום יישארו במידה רבה לא ידועים.
שילוב mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת, אנו מפתחים גישות משוחדת לזיהוי בו זמני של גורמי חיידקים מעורבים בשלבים העיקריים של זיהומי Coxiella: 1) הפנמה בתוך תאי מארח, 2) שכפול תאיים, 3) התפשטות תא אל התא , ו 4) התמדה. עד כה, יש לנו יותר מ -1,000 מטר הוקרנוutations ב500 רצפי Coxiella קידוד, אשר סיפק לנו תובנות חסרות תקדים לתוך אינטראקציות מארח הפתוגן המסדירות פתוגנזה Coxiella 7. ראוי לציין, גישה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של פתוגנים תאיים אחרים שחולקים תכונות ביולוגיה של תא עם Coxiella.
המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן הוכיח להיות שיטה יוצאת דופן כדי להבין בזיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. עם זאת, בשל המגוון של אסטרטגיות הרחיבו על ידי חיידקים פתוגנים שונה, זיהוי והאפיון של גורמים ארסי חיידקים ושל מארח מסלולי איתות שממוקדים בזיהומים מייצגים אתגר אמיתי. זה קורא לפיתוח גישות החדשות לזיהוי בקנה מידה גדולה של רכזות אינטראקציה המארח / פתוגן מפתח. הפיתוח האחרון של, תפוקה גבוהה חדשנית וטכניקות הקרנה גבוהות תוכן מייצג משאב יקר שיכול להיות מותאם למחקר של חיידקים פתוגנים תאית 15. הנה, יש לנו בשימוש burnetii Coxiella פתוגן חיידקי zoonotic כמודל לפיתוח גישות הקרנה המשלבות mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת. Importantly, שיטת הקרנה זו מאפשרת ניטור סימולטני של שלבים מרובים של המחזור תאיים Coxiella, מתן סקירה עולמית של האסטרטגיות שפותחו על ידי חיידק זה לפלוש, לשכפל ולהתמיד בתאים נגועים.
הגישה המתוארת כאן מבוססת על שתי טכניקות מבוססות היטב, mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוסס, שיושמו בהצלחה למחקר של חיידקים פתוגנים. שילוב טכניקות אלה בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה / גבוה תוכן מאפשר לנו להעריך את ההשפעות של מספר גבוה של מוטציות חיידקים על ידי ניתוח מספר גבוה מאוד של אירועים (בדרך כלל 15,000 תאים נגועים למוטציות חיידקים הם צילמו וניתחו). זה מספק ניתוח סטטיסטי חשוב של אירועים כגון פלישת חיידקים של תאי מארח ושכפול תאיים, שהם, על ידי הטבע, כפופים לשונות גבוהות. חשוב לציין כי שורות תאים אחרות מאשר EPithelial יכול לשמש לסוג זה של הקרנה. עם זאת, תאי האפיתל שטוחים וגדולים הם אופטימליים לניתוח תמונה כאברונים תא המארח הם קלים יותר לזהות. מכיוון שרוב המיקרוסקופים אוטומטיים באופן אוטומטי יכול להתמודד עם מספר רב של צלחות, יש כמעט אין גבול למספר מוטציות שיכולות להיות מוקרן בו זמנית. בהתאם לפתוגן, זכות פחית משתמשים השימוש בepifluorescence או מיקרוסקופ confocal. זמן רכישה של תמונה יהיה בעיקר תלוי ברגישות של המצלמה מיקרוסקופ, על מספר תחומים שנרכשו בכל טוב ובמספר הערוצים שנרכשו לשדה הראייה. המשתמש יכול להחליט כיצד להתאים גורמים אלה כדי לייעל את פרוטוקול ההקרנה. כדוגמא, אנחנו צילמו צלחת / hr 96-גם אחד באמצעות התנאים שצוינו בשלב 5.1. ניתוח תמונה תלוי במידה רבה במחשב (או המקבץ של מכונות) משמש. אנו משתמשים 12 ליבות (2 x 3.06 GHz 6 ליבות), תחנת עבודה RAM 48 GB. מכונה זו דורשת approxiשלו של הדבר 40 דקות כדי לנתח תמונות שנרכשו מצלחת אחת.
היבט חשוב שיש לקחת בחשבון בעת פיתוח מבחני אלה היא ההגדרה של חדש (או אופטימיזציה של קיימים) פרוטוקולים כדי לאפשר המניפולציה ועיבוד של מספר גדול של דגימות. דוגמא טיפוסית היא הפיתוח של הגישה אחת המושבה פריימר PCR, אשר אפשרה לנו להגביר ומהירות שברי רצף ה- DNA המכילים Coxiella האתר של החדרה של כל transposon, מדוגמאות קטנות מאוד. בהתבסס על הניסיון שלנו, פולימראז באיכות גבוהה צריך להיות שנבחר בקפידה ונבדק על מנת לקבל תוצאות לשחזור. המגבלה היחידה של גישה זו עשויה להסתיר בתצפית ש, ברוב המכריע של המקרים, כ -30% מהדגימות מעובד אינם ניצול, או בשל PCR או צעדי הרצף. עם זאת, בהתחשב בכך שהבידוד של מוטציות transposon Coxiella החדשות הוא לא צעד שער הגבלה, זה לא repreנשלח לנושא מרכזי. באופן דומה, הפיתוח של assay אמין לכמת את ריכוז החיידקים של מניות מוטציה היה מפתח לגישה זו. בשל הנטייה של Coxiella כדי לצבור כאשר בהשעיה, השימוש בקריאת צפיפות אופטית אינו ישימה לחישוב הריכוז של תרבויות Coxiella והחלופה היחידה הקיימת היה PCR כמותית (QPCR). כאן, שימוש סוכן intercalating DNA מתויג fluorescently של האיץ באופן משמעותי את quantitation חיידקים.
גישה זו יכולה גם לנצל את השימוש בשורות תאי יציבות להביע סמני ניאון לכמה תאים תאיים בהתאם לפתוגן בשימוש. היבט חשוב נוסף הוא השימוש בתרבית תאי תקשורת נטולת פנול אדום. הבחנו כי יש אינדיקטור pH זה הקרינה טבעית המשתרעת הספקטרום האדום וירוק שמרווה את האות נרשמה על קורא הקרינה האוטומטית.
Tהוא האסטרטגיה שהוצגה כאן מסתמכת על mutagenesis transposon האקראי. למוטציות של עניין, אנו ממליצים אימות חילופים וייחודיים (וclonality) באמצעות כתם הדרום וamplifications PCR של אתר הכנסת transposon.
מלבד הציוד שתואר בסעיף הפרוטוקול, צוותי המעוניינים להשתמש בגישת ההקרנה שהוצגה כאן, ינצלו גדול בהקמה של מסדי נתונים יחסיים לאיסוף נתונים, שרת לאחסון נתונים ותחנת עבודה לניתוח תמונה מהיר.
חשוב לציין, בשיטה שתוארה כאן מתאים למחקר של חיידקים פתוגנים תאיים אחרים הניתנת על שיטת mutagenesis אקראית קיימת לפתוגן, יכולות להיות נגועות שורות תאים על ידי פתוגן וזה אחד מציג פנוטיפ ספציפי בזיהום.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |