Summary

In Situ rilevamento di batteri all'interno dei tessuti in paraffina utilizzando una sonda DNA Digossina marcato targeting 16S rRNA

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

I batteri svolgono un ruolo nell'eziologia di varie malattie orali come la parodontite, pulpite, pericoronite, cellulite e osteomielite. Per comprendere il ruolo dei batteri nella patogenesi della malattia e per monitorare l'effetto dei trattamenti, localizzazione di batteri all'interno del tessuto è importante. La presenza di batteri all'interno del tessuto gengivale di pazienti con periodontite è stato dimostrato utilizzando vari metodi, tra cui la microscopia elettronica 1,2, immunoistochimica e immunofluorescenza usando specifici anticorpi batteri-3-7 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) 8 utilizzando un fluorescence- sonda oligonucleotide etichettato mira 16S rRNA. Tuttavia, questi metodi non sono ampiamente utilizzati a causa di limitazioni o difficoltà tecniche. Rispetto anticorpi, sonde destinate 16S rRNA sono facili da produrre e realizzare specie specificità. FISH ha dimostrato di essere un ottimo strumento per la visualizzazione di bacteria nei loro ambienti naturali, come la placca biofilm. Tuttavia, l'applicazione di FISH a campioni di tessuto è limitata a causa di autofluorescenza di varie componenti del tessuto. Ad esempio, il forte autofluorescenza di globuli rossi spesso ostacola l'applicazione della tecnologia di fluorescenza ai tessuti infiammati quando coinvolgono sanguinamento 9.

Per localizzare batteri all'interno dei tessuti gengivali infiammati, quindi, un metodo di ibridazione in situ usando un digossigenina (DIG) sonda di DNA -labeled è stato sviluppato e applicato con successo 10,11. Qui un protocollo dettagliato per la localizzazione di batteri nei tessuti inclusi in paraffina utilizzando P. gingivalis sonde eubatteriche specifico d'e universali è stata descritta. È particolarmente focalizzato sulla standardizzazione del metodo in modo che risultati simili possono essere riprodotti in altri laboratori. Questo protocollo permette la localizzazione dei batteri all'interno del loro contesto istologica e il resuLTS sono altamente riproducibili. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare batteri sia in modo specie-specifico o universale in vari tessuti. La sonda universale è particolarmente utile per rilevare batteri nelle malattie polimicrobiche e studiare un potenziale ruolo dei batteri nelle malattie dove il ruolo di batteri specifici non è noto.

Protocol

1. Preparazione della sonda Amplificazione PCR della sonda Per la P. Sonda gingivalis -specific, amplificare un frammento di DNA 343 bp di P. gingivalis 16S rRNA mediante PCR utilizzando DNA genomico di P. gingivalis e le seguenti primer: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'e 5'AGIRE CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Eseguire amplificazioni con le seguenti condizioni ciclo: 35 cicli a 95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1 min 20 …

Representative Results

La figura 1 mostra puntino assorbente di sonde DIG-marcate rispetto con la sonda di controllo positivo fornito nel kit per determinare la loro sensibilità. Il 343 bp P. Sonda gingivalis -specific è 25 volte più sensibile rispetto alla sonda eubatterica 70 bp. La figura 2 mostra l'ibridazione in situ dei tessuti gengivali ottenuti da pazienti con parodontite cronica per il rilevamento di P. gingivalis e eubatteri. I segnali batteriche, mostrati …

Discussion

Qui un protocollo per localizzare i batteri all'interno dei tessuti inclusi in paraffina utilizzando una sonda di DNA DIG marcato è stato descritto. La sonda obiettivi dei DNA o RNA molecole batterica gene 16S rRNA, e le sonde 16S rRNA-mirate può essere progettato come entrambe le specie-specifico o universale. L'ibridazione specifica del P. Sonda gingivalis -specific a P. gingivalis ma non ad altri batteri orali è stato mostrato in precedenza 10. Al contrario, la sonda e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (2013R1A1A3005669) dal National Research Foundation di Corea e una borsa di studio (HI13C0016) del coreano Salute Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare.

Materials

Acetic anhydride Sigma 6404
50% Dextran sulfate solution Millipore S4030
50X Denhardt’s solution Sigma D2532
DEPC Sigma P159220
DIG DNA labeling and detection kit Roche 11 093 657 910
Formamide Sigma F9037
ImmEdge™ Pen Dako H-400
Levamisole Vector SP-5000
Magnesium chloride Sigma 246964
Maleic acid Sigma M0375
Methyl green Sigma M6776
Paraformaldehyde Sigma P1648
Permount Fisher SP15-500
Salmon sperm DNA solution Invitrogen #15632-011
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium citrate Duksan D1420
Sodium dodecyl sulfate Amresco 227
Triethanolamine-HCl Sigma 90279
Tris-HCl Research organics 3098T

References

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Cite This Article
Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836, doi:10.3791/52836 (2015).

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