Summary

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

חיידקים לשחק תפקיד באטיולוגיה של מחלות פה שונות כגון חניכיים, דַלֶקֶת הַמוֹך, pericoronitis, צלוליטיס, ודלקת עצם. על מנת להבין את תפקידם של חיידקים בפתוגנזה של מחלה ולעקוב אחר ההשפעה של טיפולים, לוקליזציה של חיידקים בתוך הרקמה חשובה. הנוכחות של חיידקים בתוך רקמת חניכיים מחולים עם מחלת חניכיים הוכחה בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים 1,2, אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence באמצעות חיידקים ספציפיים נוגדנים 3-7, וניאון הכלאה באתר (דגים) 8 באמצעות fluorescence- הבדיקה oligonucleotide שכותרתו מיקוד rRNA 16S. עם זאת, שיטות אלה אינן בשימוש נרחב בשל מגבלה או קשיים טכניים. לעומת נוגדנים, בדיקות מיקוד rRNA 16S קלות לייצר ולהשיג מינים-סגוליות. FISH הוכיח להיות כלי מצוין להדמיה של התרהeria בסביבתם הטבעית כגון biofilm שלט. עם זאת, יישום של דגים לדגימות רקמה מוגבל בשל autofluorescence של רכיבי רקמות שונים. לדוגמא, autofluorescence החזק של תאי דם אדומים לעתים קרובות מעכב את היישום של טכנולוגית הקרינה לרקמות מודלקות כשהם כרוכים בדימום 9.

כדי למקם חיידקים בתוך רקמות החניכיים המודלקות, ולכן, באתר שיטת הכלאה באמצעות digoxigenin (DIG) הבדיקה DNA -labeled פותחה ומיושמת בהצלחה 10,11. כאן פרוטוקול מפורט ללוקליזציה של חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות פ בדיקות eubacterial -specific והאוניברסליות gingivalis תוארו. הוא התמקד בעיקר בסטנדרטיזציה של השיטה כדי שניתן תהיה לשכפל תוצאות דומות במעבדות אחרות. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה של חיידקים בתוך ההקשר היסטולוגית שלהם וresuLTS הם מאוד לשחזור. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי למקם חיידקים או באופן מינים ספציפיים או אוניוורסלי ברקמות שונות. הבדיקה האוניברסלית שימושית במיוחד כדי לזהות חיידקים במחלות polymicrobial וללמוד את תפקיד פוטנציאלי של חיידקים במחלות שבי התפקיד של חיידקים מסוימים אינו ידוע.

Protocol

1. בדיקה הכנה ההגברה PCR של החללית לפ הבדיקה -specific gingivalis, להגביר קטע DNA 343-נ"ב של פ rRNA 16S gingivalis על ידי PCR באמצעות הדנ"א הגנומי של פ gingivalis ופריימרי?…

Representative Results

מופעי איור 1 dot סופג של בדיקות שכותרת DIG לעומת הבדיקה הבקרה החיובית המסופקת בערכה כדי לקבוע את רגישותם. 343 נ"ב פ הבדיקה -specific gingivalis היא 25 פעמים יותר רגישה מבדיקת eubacterial 70 נ"ב. איור 2 מראה הכלאה באתר של רקמות חניכיים המתקבלות מחולים עם …

Discussion

הנה פרוטוקול למקם חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות בדיקה DNA שכותרת DIG תואר. הבדיקה מתמקדת במולקולות ה- DNA או RNA של גן 16S rRNA חיידקים, ויכולות להיות מתוכננות בדיקות 16S rRNA המיקוד כמו גם מינים ספציפיים או אוניוורסלי. הכלאה מסוימת של פ הבדיקה -specific gingivalis לפ gingival…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק (2013R1A1A3005669) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה ומענק (HI13C0016) של בריאות הטכנולוגיה מו"פ פרויקט, משרד הבריאות והרווחה הקוריאני.

Materials

Acetic anhydride Sigma 6404
50% Dextran sulfate solution Millipore S4030
50X Denhardt’s solution Sigma D2532
DEPC Sigma P159220
DIG DNA labeling and detection kit Roche 11 093 657 910
Formamide Sigma F9037
ImmEdge™ Pen Dako H-400
Levamisole Vector SP-5000
Magnesium chloride Sigma 246964
Maleic acid Sigma M0375
Methyl green Sigma M6776
Paraformaldehyde Sigma P1648
Permount Fisher SP15-500
Salmon sperm DNA solution Invitrogen #15632-011
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium citrate Duksan D1420
Sodium dodecyl sulfate Amresco 227
Triethanolamine-HCl Sigma 90279
Tris-HCl Research organics 3098T

References

  1. Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
  2. Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
  3. Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
  4. Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
  5. Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
  6. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  7. Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
  8. Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
  9. Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
  10. Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
  11. Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
  12. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
  13. Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
  14. Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
  16. Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).

Play Video

Cite This Article
Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836, doi:10.3791/52836 (2015).

View Video