Summary

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

Published: October 05, 2015
doi:

Summary

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Abstract

Der adoptive Transfer von Pathogen-spezifische T-Zellen können verwendet werden zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionen, wie Cytomegalievirus (CMV) nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation auftritt. Viral-spezifischen T-Zellen von allogenen Spendern, einschließlich Dritter Spender kann ex vivo vermehrt werden in Übereinstimmung mit den geltenden Guten Herstellungspraxis (cGMP) und beschäftigt wiederholte Runden von Antigen-angetriebenen Stimulation, um die gewünschten T-Zellen selektiv zu verbreiten. Die Identifizierung und Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen kann auch auf der Grundlage der Zytokin-Capture-System der T-Zellen, die aktiviert wurden, um gamma-Interferon (IFN-γ) sekretieren vorgenommen werden. Doch weit verbreiteten Menschen Anwendung der Zytokin-Capture-System (CCS) zur Wiederherstellung der Immunität wurde begrenzt, wie der Produktionsprozess ist zeitaufwendig und erfordert einen erfahrenen Bediener. Die Entwicklung einer zweiten Generation Zellanreicherung Vorrichtung wie CliniMACS Prodigy jetztermöglicht Ermittler viral-spezifischen T-Zellen unter Verwendung eines automatisierten, weniger arbeitsintensiv System zu erzeugen. Diese Vorrichtung trennt magnetisch von unmarkierten Zellen durch magnetische Zellsortierung Technologie klinischem Produkte erzeugen markierten Zellen wird als ein geschlossenes System konstruiert und zugegriffen werden kann und gegen die Arbeitsfläche betrieben werden. Wir demonstrieren die Funktionsweise dieser neuen automatisierten Zellanreicherungsvorrichtung zur CMV pp65-spezifischen T-Zellen, die aus einer stationären Apherese Produkt von einem CMV-seropositiven Spender erhalten erhalten herzustellen. Diese isolierten T-Zellen können dann direkt in einen Patienten unter institutionellen und bundesstaatlichen Regulierungsaufsicht infundiert werden. Alle Bio-Verarbeitungsschritten einschließlich der Entfernung der roten Blutkörperchen, die Stimulation von T-Zellen, die Trennung von Antigen-spezifischen T-Zellen, Reinigung und Waschen sind voll automatisiert. Geräte wie dies die Möglichkeit, dass T-Zellen für die Anwendung beim Menschen kann außerhalb gewidmet guten Herstellungspraxis (GMP hergestellt werden) Einrichtungen und stattdessen in Blutbanken Einrichtungen, in denen Mitarbeiter können automatisierte Protokolle überwachen, um mehrere zu produzieren werden.

Introduction

Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) 1 kann mit Adoptiv-T-Zell-Therapie kombiniert werden, um Graft-versus-Tumor-Wirkung zu verbessern und Immunität gegen opportunistische Infektionen 2 bereitzustellen. Erzeugung von Antigen-spezifischen Spender abgeleiteten T-Zellen für die Infusion hat historisch erforderlichen Fachkräfte und die Verwendung von spezialisierten Einrichtungen, die GMP-konform sind. Die Lieferung solcher T-Zellen wurde in der Entschließung des opportunistischen Infektionen 3 sowie Behandlung der zugrunde liegenden malignen 4 geführt. Vor kurzem haben Forscher gezeigt, dass der adoptive Transfer von nur wenigen tausend Virus-spezifischen T-Zellen (~ 1 x 10 4 bis 2,5 x 10 5 Zellen / kg Körpergewicht des Empfängers) opportunistische CMV Infektionen nach alloHSZT 5-9 erfolgreich zu behandeln. Eine begrenzte Anzahl von GMP-Anlagen mit zugehörigen Fachfertigungsanforderungen und der hohen Kosten, die mit der Zellproduktion assoziiert hat jedoch restricted Patienten den Zugang zu vielversprechenden T-Zelltherapien 10. Ein Ansatz zum Isolieren von antigenspezifischen T-Zellen basiert auf den CCS Verwendung eines bispezifischen Reagenzes an CD45 und IFN-γ erkennt beruht. Wie gezeigt ist, kann diese Methode verwendet werden, um klinische Studien zu CMV-spezifische T-Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellanreicherung CCS Einrichtung (1B) zu erzeugen.

CMV-spezifische T-Zellen werden durch Inkubation von überlappenden Peptiden von CMV pp65 Antigens mit Leukapherese Gesamtkernzellen (TNC) von CMV-seropositiven Spendern erzeugt. Diese Peptide im Kontext von Human-Leukozyten-Antigen (HLA) angezeigt wird, aktivieren die CMV pp65-spezifischen T-Zellen innerhalb der TNC zu IFN-γ sezernieren. Diese T-Zellen können dann "eingefangen" werden und magnetisch getrennt. Der Betrieb der ersten Generation Zellanreicherungseinrichtung (1A) unter GMP-Bedingungen erforderliche Personal Mann Zellkultur, und die Koordination der Mitarbeiter, um die Mehrfach s verpflichtenTEPs notwendig, eine "eingefangen" Produkt zu erzeugen.

Das Verfahren in der Regel erforderlich, 10 bis 12 h Dauerbetrieb, und damit Personal wahrscheinlich benötigen, um mehr als zwei Schichten in der GMP-Anlage zu arbeiten. Diese Beschränkungen werden nun durch die Durchführung einer zweiten Erzeugungsvorrichtung (in 1B gezeigt) vermieden. Diese Vorrichtung übernimmt magnetische Anreicherung, ähnlich zu der ersten Erzeugungseinrichtung, aber automatisiert andere Aspekte der CCS in einem unbreached Ansatzes. Dies reduziert die Belastung für die GMP-Team als die meisten Schritte können unbeaufsichtigt von Mitarbeitern durchgeführt werden. Da ferner die Vorrichtung arbeitet als geschlossenes System, können die Antigen-spezifischen T-Zellen, aufgenommen und gegen die Arbeitsfläche mit Ausnahme der Schritte in Leukapherese Isolierung und Herstellung von Materialien vor dem Starten des Instruments eingebundenen verarbeitet werden. Details des kompletten Instrumentierung und Funktionalität dieser zweiten Generation Zellanreicherungsvorrichtung wurden published 11.

Hier beschreiben wir die Schritte zum CMV pp65-spezifischen T-Zellen aus einer stationären Aphereseprodukt Verwendung des automatischen Zellanreicherung CCS-System anzureichern. Nachdem sie isoliert wurde, kann diese CMV-spezifische T-Zellen sofort in einen Patienten infundiert werden.

Protocol

1. Herstellung des Materials unter sterilen Bedingungen (siehe Materialien und Geräte Tabelle) Vorbereitung 3 l PBS / EDTA-Puffer mit humanem Serumalbumin (HSA) ergänzt, um eine Endkonzentration von 0,5% (w / v). Bereiten Sie 1 L Tasche von klinischen Grade 0,9% Natriumchlorid (NaCl) -Lösung und 2 l GMP Grade-Zellkulturmedium. Bereiten Sie 60 nmol von CMV-spezifischen Peptid-Antigen-Cocktail durch Rekonstitution eines Fläschchens CMV pp65 mit 8 ml sterilem Wasser. Bringen CMV…

Representative Results

In dieser Studie wurde eine automatisierte Zellanreicherung CCS System zur automatisierten Erzeugung von CMV pp65-spezifischen T-Zellen verwendet. CMV-spezifische T-Zellen wurden aus drei Apherese Zellprodukten angereichert. Die Steady-State-Apherese-Produkt wurde über 2 Stunden von einem CMV-seropositiven Spender 10 10 Gesamtkernzellen (TNC) geerntet und erzeugt. 10 9 TNC wurden dann mit CMV pp65 abgeleitete Peptide (60 nmol) für 4 Stunden und die IFN-γ sezernierenden T-Zellen wurden mit Hilfe …

Discussion

Adoptive T-Zell-Therapie hat sich als praktikable Option, um B-Zell-Malignitäten 4 Behandlung entstanden. Sein therapeutisches Potential ist abhängig von der Infusion der gewünschten Anzahl von Ziel-Antigen spezifischen T-Zellen, die replikative Seneszenz 2 fehlt. Dies kann durch Aussortieren eine reine Population von Antigen-spezifischen T-Zellen aus expandierten T-Zellen in Übereinstimmung mit den geltenden guten Herstellungspraxis erreicht werden kann. Zwei Sortierverfahren sind weit verbrei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.

Materials

CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag Miltenyi Biotec GmbH 700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 Miltenyi Biotec GmbH 130-097-182
5 L waste bag Miltenyi Biotec GmbH 110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) Miltenyi Biotec GmbH 279-01
Albumin (Human) 25%  Grifols 58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector Miltenyi Biotec GmbH 130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L) Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 Miltenyi Biotec GmbH 170-076-109
Water for injections Hospira, inc, Lake Forest, IL NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm  Millipore SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag Miltenyi Biotec GmbH 170-076-306
Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) Miltenyi Biotec GmbH 130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec GmbH 200-074-400
60 mL Syringes, sterile BD, Laagstraat, Temse, Belgium 309653
CMV sero positive apheresis product Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials Manufacturer Catalog number
AB Serum, GemCell Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA 100-512
CD3-FITC Miltenyi Biotec GmbH 130-080-401
CD4-APC Miltenyi Biotec GmbH 130-098-033
CD8-APC-Vio770 Miltenyi Biotec GmbH 130-098-065
CD14-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-072
CD20-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-077
CD45-VioBlue Miltenyi Biotec GmbH 130-098-136
aIFN-γ-PE, human Miltenyi Biotec GmbH 130-097-940
CD3-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) Miltenyi Biotec GmbH 130-093-233
Equipment Manufacturer Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device  Miltenyi Biotec GmbH 200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec GmbH 130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R  Eppendorf AG 22331
Cellometer K2 Nexelom Bioscience, Lawrence, MA LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB Terumo Medical Corp., Elkton, MA 7811

References

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Cite This Article
Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes, J. S., Huls, M. H., Tewari, P., Shpall, E. J., Champlin, R., Cooper, L. J. Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System. J. Vis. Exp. (104), e52808, doi:10.3791/52808 (2015).

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