Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
De adoptieve overdracht van pathogeen-specifieke T-cellen kunnen worden gebruikt ter voorkoming en behandeling van opportunistische infecties zoals cytomegalovirus (CMV) infecties optreden na allogene hematopoietische stamceltransplantatie. Viraal-specifieke T-cellen van allogene donoren, met inbegrip van derden donoren, kan worden vermeerderd ex vivo in overeenstemming met de huidige goede fabricagepraktijken (cGMP), het gebruik van herhaalde rondes van antigeen-gedreven stimulatie om de gewenste T-cellen selectief te propageren. De identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen kunnen ook worden uitgevoerd op basis van de cytokine beeldverwerkingssysteem van T-cellen die zijn geactiveerd met gamma-interferon (IFN-γ) afscheiden. Echter verbreide toepassing van het cytokine beeldverwerkingssysteem (CCS) voor het herstel van immuniteit beperkt als het productieproces is tijdrovend en vereist een ervaren operator. De ontwikkeling van een tweede generatie cel verrijking apparaat zoals CliniMACS Prodigy nustelt onderzoekers virus-specifieke T-cellen met behulp van een geautomatiseerde, minder arbeidsintensief systeem genereren. Dit apparaat scheidt magnetisch gemerkte cellen van niet-gemerkte cellen met behulp van magnetische geactiveerd celsortering technologie van klinische kwaliteit producten genereren, is ontworpen als een gesloten systeem en kan worden benaderd en uitgevoerd op de benchtop. We tonen de werking van dit nieuwe geautomatiseerde celverrijking apparaat CMV verkregen van een steady-state aferese verkregen uit een CMV seropositieve donor pp65-specifieke T-cellen produceren. Deze geïsoleerde T-cellen kunnen vervolgens direct worden toegediend in een patiënt onder institutionele en federale regelgeving toezicht. Alle stappen bioprocessen inbegrip van verwijdering van rode bloedcellen, wordt stimulatie van T-cellen, afscheiding van antigen-specifieke T-cellen, zuivering en wassen volledig geautomatiseerd. Apparaten zoals deze verhogen de mogelijkheid dat T-cellen voor toepassing op de mens buiten gewijd goede fabricagemethoden (GMP kan worden vervaardigd) Faciliteiten en in plaats daarvan worden geproduceerd in het bloed bancaire faciliteiten waar het personeel geautomatiseerde protocollen kunnen begeleiden om meerdere producten te produceren.
Introduction
Hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) 1 te combineren met adoptieve T-celtherapie verbeteren graft-versus-tumor effect en immuniteit voor opportunistische infecties 2. Genereren van antigenspecifieke donor afgeleide T-cellen voor infusie verleden vereiste geschoold personeel en het gebruik van gespecialiseerde faciliteiten die GMP-compliant zijn. De levering van de T-cellen heeft geleid tot een resolutie van opportunistische infecties 3, alsmede de behandeling van de onderliggende maligniteit 4. Onlangs hebben onderzoekers aangetoond dat de adoptieve overdracht van slechts enkele duizenden virus-specifieke T-cellen (1 x 10 ~ 4 – 2,5 x 10 5 cellen / kg lichaamsgewicht van de ontvanger) kan met succes opportunistische CMV infecties na allogene HSCT 5-9 behandelen. Een beperkt aantal GMP faciliteiten met bijbehorende geschoolde productievereisten en de hoge kosten in verband met celproductie is echter restricted patiënt toegang tot veelbelovende T-cel therapieën 10. Een benadering voor het isoleren van antigeen-specifieke T-cellen is gebaseerd op de CCS met een bi- specifiek reagens voor CD45 en IFN-γ herkennen. Zoals wordt getoond, kan deze methode worden gebruikt om de klinische kwaliteit CMV-specifieke T-cellen toepassing van een geautomatiseerde celverrijking CCS inrichting (figuur 1B) te genereren.
CMV-specifieke T-cellen worden gegenereerd door het incuberen van overlappende peptiden van CMV pp65 antigen met leukaferese totale nucleaire cellen (TNC) van CMV seropositieve donoren. Deze peptiden, weergegeven in de context van humane leukocyt antigeen (HLA), activeert de CMV pp65-specifieke T-cellen in de TNC IFN-γ scheiden. Deze T-cellen kunnen vervolgens worden "gevangen" en magnetisch gescheiden. De werking van de eerste generatie cel verrijking inrichting (figuur 1A) vereiste personeel bekwaam in celkweek onder GMP condities en coördinatie van personeel voor de meervoudige s ondernemenTEPS noodzakelijk een "gevangen" product te genereren.
De procedure vereist gewoonlijk 10 tot 12 uur van continue werking, en daarom waarschijnlijk personeel moet werken dan twee verschuivingen in de GMP faciliteit. Deze beperkingen zijn nu ondervangen door de invoering van een tweede-generatie-inrichting (figuur 1B). Dit apparaat verbindt magnetische verrijking, vergelijkbaar met de eerste generatie apparaat, maar automatiseert andere aspecten van de CCS een unbreached benadering. Dit vermindert de belasting van de GMP-team als de meeste van de stappen kan zonder toezicht door het personeel worden uitgevoerd. Aangezien de inrichting werkt als een gesloten systeem, de antigen-specifieke T-cellen kan worden opgevangen en verwerkt op stationaire behalve de stappen van leukaferese isolatie en bereiding van materialen voordat het instrument. Details van de volledige instrumentatie en functionaliteit van deze tweede generatie cel verrijking apparaat zijn pubsteld 11.
Hier beschrijven we de stappen CMV pp65-specifieke T-cellen te verrijken door een steady-state aferese product de geautomatiseerde celverrijking CCS systeem. Eenmaal geïsoleerd kunnen deze CMV-specifieke T-cellen direct worden toegediend in een patiënt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adoptieve T-celtherapie heeft ontpopt als een haalbare optie voor B-cel maligniteiten 4 behandelen. Het therapeutisch potentieel is afhankelijk infuseren het gewenste aantal doelwitantigeen specifieke T-cellen die replicatieve senescentie 2 ontberen. Dit kan worden bereikt door het uitzoeken van een zuivere populatie van antigeen-specifieke T-cellen van geëxpandeerde T-cellen in overeenstemming met de huidige good manufacturing practices. Twee sorteren procedures worden veel gebruikt, namelijk, fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
