Se describe un método ex vivo de la máquina de perfusión de injertos de hígado humano a temperatura subnormothermic (21 ° C).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
El trasplante hepático es el único tratamiento curativo para decenas de miles de pacientes que sufren de enfermedad hepática terminal. Para facilitar el éxito del trasplante, la preservación óptima del hígado desde el momento en que se adquirió desde el donante hasta el momento en que se implanta en el receptor es necesario para evitar el rápido deterioro del injerto. El estándar actual para la conservación del hígado se denomina 'almacenamiento en frío estático': el hígado se enfría en una solución de conservación en refrigeración con hielo, reduciendo así el metabolismo del hígado y ralentizar los efectos deletéreos de la isquemia. Aunque esta técnica de almacenamiento en frío ha permitido el éxito del trasplante, los órganos de calidad marginal, como órganos DCD dañados por la isquemia caliente o esteatosis paciente muestran resultados inferiores 1. Hay un cuerpo de rápida expansión de evidencia de que la máquina de perfusión ex vivo de los injertos de hígado como una modalidad alternativa de preservación puede potencialmente improbar los resultados para estos órganos marginales 2,3.
El trasplante de hígado se ha convertido en una víctima de su propio éxito. Muchos más pacientes son remitidos para trasplante que hay hígados disponibles, y miles de personas mueren en lista de espera en los Estados Unidos cada año. Teniendo en cuenta la realidad de la escasez de donantes de hígado y la creciente utilización de injertos de hígado de calidad subóptima para los beneficiarios necesitados, se sostiene ampliamente que ex vivo máquina de perfusión de los injertos hepáticos antes de la implantación mantiene la promesa de un cambio de paradigma en el trasplante hepático. Ha habido un marcado aumento en interés de la investigación en este tema en los últimos años 4-8. En diversos centros europeos y norteamericanos máquina de perfusión hipotérmica ha hecho una introducción 8 y normothermic máquina de perfusión clínica a temperaturas fisiológicas se ha aplicado recientemente a hígados humanos desechados y está siendo traducido al uso clínico y 9.Extenso desarrollo ha llevado al desarrollo de diversos protocolos, mientras que la optimización continua identifica parámetros de la perfusión óptima 10-12. El uso de injertos de calidad marginal se ha incrementado más de 10 veces en la última década 13. Cuando se compara con el estándar actual para la preservación del hígado (almacenamiento en frío estática), la perfusión ex vivo máquina proporciona numerosos beneficios potenciales, todos los que dan lugar a la tan necesaria ampliación de la piscina de órganos y un potencial disminución de la incidencia de complicaciones post-trasplante. En particular, las complicaciones biliares que afectan actualmente injertos de hígado calidad subóptima después del trasplante siguen siendo una cuestión sustancial 14-18.
Máquina de perfusión en condiciones subnormothermic ofrece una ventana de tiempo para evaluar la función del injerto más objetiva a la idoneidad para el trasplante 19. Mientras que el hígado se perfundió en un circuito ex vivo, tanto el perfundido unand la bilis producida durante la perfusión se puede muestrear para la medición de los marcadores de la función del órgano. De esta manera 'seriamente comprometida' hígados que se descartan para el trasplante, según los criterios actuales se pueden evaluar de manera objetiva en cuanto a su idoneidad para el trasplante. Evaluación de la viabilidad potencialmente permite para muchos de estos órganos para ser utilizada para el trasplante. Un igualmente poderoso beneficio de máquina de perfusión es la reparación y mejora de los hígados que han sido dañados por la isquemia caliente / frío. ATP se agota muy rápidamente durante el calentamiento y posterior isquemia fría y se puede repleted durante un período de máquina de perfusión antes de la implantación del hígado 20. El hígado, con sus reservas de energía y estado metabólico repone, se preacondicionará y mejor preparados para los efectos perjudiciales de la lesión por reperfusión después de la implantación en el receptor.
Este trabajo describe un método ex vivo máquina de perfusión de graf hígado humanots en el laboratorio, lo que será útil para los investigadores que deseen estudiar tanto la técnica y los efectos beneficiosos de la perfusión ex vivo máquina. Hacemos uso de hígados de donantes humanos que se han disminuido para el trasplante y luego son asignados para fines de investigación.
Técnica de la contratación hígado estándar implica en ras arterial in situ del hígado tras el pinzamiento aórtico en donantes con muerte cerebral (DBD) o después de la parada circulatoria en donantes circulatorios muerte (DCD), que se describen en más detalle en otra parte 20. Además, el hígado se enfría durante la adquisición llenando la cavidad abdominal del donante con hielo. Preferencias solución de lavado varían entre regiones, con la mayoría de contratación con la Universidad de La histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK) solución de Wisconsin o. Un back-ras tabla adicional de la vena portal mejora la de lavado de la sangre residual. Los hígados son a menudo adquiridos dejando un sur segmento aórticoredondeo del tronco celíaco. La vesícula biliar se realiza una incisión, la bilis se aspira, y el conducto biliar se vacía. Los hígados se empaquetan en bolsas estériles que contienen solución de preservación en frío con hielo y se transportan en cajas o enfriadores designados. Para obtener resultados representativos cálido y frío tiempo de isquemia se debe limitar a 60 minutos y 12 horas, respectivamente. A pesar de un control serológico de rutina para los patógenos transmisibles, se deben tomar las precauciones normales al manejar los órganos humanos, las muestras obtenidas de órganos humanos, y cualquier producto de desecho.
El protocolo aquí se describe la máquina de perfusión subnormothermic usando un dispositivo de perfusión del hígado disponible comercialmente. El uso de un dispositivo de este tipo permite una traducción más rápida para el entorno clínico y de validación cruzada de los diferentes protocolos y la configuración del dispositivo entre grupos de investigación y centros de trasplante.
En un intento de recuperar hígados heridos durante la isquemia hemos desarrollado un sistema SNMP que se puede emplear después de un período de almacenamiento en frío. Máquina de perfusión Subnormothermic ofrece una alternativa viable para el almacenamiento en frío convencional, así como las modalidades de la máquina de perfusión hipotérmica y normotérmicos. Existen varios sistemas diferentes; todos ofrecen diferentes ventajas y desventajas 3,9,20. SNMP permite la perfusión sin un portador de oxígeno, como las demandas de oxígeno del metabolismo en 21 ° C se reunió por la oxigenación activa de la perfusión.
Aunque se ha reducido en condiciones subnormothermic, el metabolismo es importante y requiere el apoyo de una solución de perfusión rica en nutrientes. Disoluciones de perfusión tradicionales, tales como la solución de Belzer máquina de perfusión, son generalmente mínimo en la composición y están diseñados para la perfusión fría. Williams 'Medium E se ha utilizado como un medio de cultivo de hepatocitos durante muchos años, y contiene cOMPONENTES que son universales para apoyar la función celular, en particular bajo condiciones cálidas ex vivo.
Las mediciones realizadas durante la máquina de perfusión son un reflejo de la función del órgano. Parámetros directamente observables, tales como la producción de bilis y el consumo de oxígeno son mediciones en tiempo real que pueden ser utilizados para evaluar el hígado pre-trasplante. Del mismo modo, los marcadores de la lesión celular y la isquemia (K +, la liberación de lactato) se pueden medir directamente en la solución de perfusión y pueden ser indicativos de la función del órgano 20. Como la tecnología de máquina de perfusión desarrolla y logra aplicación clínica más generalizada, las correlaciones precisas entre ex vivo la función y el resultado clínico se pueden hacer y parámetros de perfusión serán útiles en ayudar a las decisiones de trasplantar o rechazar hígados calidad marginal. Además, como punto de atención herramientas analíticas adelantado, un análisis más sofisticado estará disponible directamente en la máquina perfusión 21.
En este trabajo se muestra que el hígado se pueden apoyar en el sistema SNMP con mínima lesión al hígado, que se refleja por la histología y la liberación de ALT. La recuperación funcional del hígado se refleja mejor por el ATP, que se ha demostrado que se correlaciona con la viabilidad de hígado y es fuertemente sugestivo de éxito del trasplante en modelos animales 22. Ex vivo y recuperación previa al trasplante de injertos de hígado permitiría una expansión significativa del donante piscina hígado, corregir la disparidad entre la oferta y la demanda de hígados de donantes en el trasplante.
The authors have nothing to disclose.
La financiación de los Institutos Nacionales de Salud (otorga R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 y DK103500 F32), CIMIT Proyecto No. 12-1732 y los Hospitales Shriners para Niños Se agradece. Nos gustaría reconocer y agradecer el Banco de Órganos de Nueva Inglaterra para apoyar este trabajo.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |