뼈 조정 배지 : 준비 및 생물 검정
Summary
우리는 뼈 에어컨 매체 (BCM)을 준비하고 시험 관내에서 활동을 테스트하는 방법을 여기에 대해 설명합니다.
Abstract
자가 뼈 이식 널리 구강 악안면 외과, 정형 외과 및 외상에 사용됩니다. 자가 뼈 이식은 누락 된 뼈를 대체하지, 그들은 또한 골 재생의 복잡한 과정을 지원합니다. 자가 이식이 유리한 동작은 세 가지 특징에 기인한다 : osteoconductivity, osteogenicity 및 osteoinductivity을. 그러나, 다른 측면이있다 : 뼈 골 재생에 관련된 중간 엽 세포를 대상으로 할 수 성장 인자를 포함하여 분자의 무수 해제 접목. 골 이식의 분비 속성은 뼈 에어컨 매체 (BCM)를 사용하여 시험 관내에서 공부하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 열 처리 또는 탈회를 시행 기본 돼지 피질 뼈에서 뼈 에어컨 매체를 준비하는 방법에 대한 프로토콜 및 뼈를 제시한다. 세포는 직접 BCM에 노출 또는 콜라겐 멤브레인, 이전 BCM 적신 같은 생체 재료,에 접종 할 수있다. 우리는 체외 bioassa에 대한 예를들TGF-β 조절 유전자의 발현에 중간 엽 세포와 YS. 제시된 프로토콜은 추가 골 재생시 뼈 이식의 분비 효과를 밝혀 및 재건 수술의 폭 넓은 분야의 중개 연구에 대한 경로를 엽니 다 장려해야한다.
Introduction
자가 뼈 널리 기형의 결과, resective 수술, 재건 외상 수술, 이전 임플란트 식립 1, 2에로 발생한 결함을 연결하는 데 사용됩니다. 뼈 이식은 이식 통합의 과정을 지원하는 방법의 생물학적 원리를 이해하는 것은자가 이식이 재건 수술의 황금 표준으로 간주하는 이유를 이해하기 만 키가 아닌, 그것은 또한 뼈 대체 (3)의 개선 된 디자인에 생체 공학입니다. 그러나 이식 통합은 빠른자가 뼈와 뼈가 4,5 대체 비교된다. 따라서, 골 재생을 지원하기 때문에 효과적인 자가골을 분자 세포 메커니즘을 나타 내기 위해 필수적이다.
통합 프로세스의 6,7을 지원하는 것으로 간주되는자가 이식의 세 교과서의 특성이 있습니다. 첫째,자가 뼈가 성장하는 새로 형성된 뼈에 대한 지침을 제공, osteoconductive입니다결함에. 둘째,자가 뼈는 조골 세포 (8)로 분화 할 수 중간 엽 세포를 포함 즉, 골 형성이다. 매트릭스 내에 안치 뼈 형태 형성 단백질 유사 성장 인자 연골 또는 골 형성 intramembranous (9)의 처리를 개시 할 수있다 셋째, 자가골은 골 유도된다. 또 다른 측면이있다 : 갓 준비 뼈 칩은 "뼈 에어컨 매체"10 ~ 15과 체외 관찰을 기반으로 분비 기능을 유지. 또한 myelopoiesis의 영향은 16를 언급한다. "탈회 골 기질 – 조정 배지"A와 유사한 용어는 이미 탈회 (17)에 의해 처리 된 경우에도, 1996 년 낸 뼈의 분비 기능의 전체적인 개념을 지원 하였다. 우리의 목적을 위해, BCM은 10,11 하악골 신선한 돼지로부터 제조 될 수있다. BCM의 프로테옴 분석은 성장의 사실을 포함하여, 복잡한 구성을 밝혀ORS과 세포 외 기질 (10)의 성분은, 또한 전체의 뼈 18,19 테아의 기존 기술을 연장. 따라서, BCM은 시험관 내에서 뼈 이식의 다양한 변형의 공개 활동을 반영해야한다.
중간 엽 세포는, 예를 들어 뼈 칩 또는 구두 부드러운 조직에서 분리 된 사람들을 위해, BCM 수 있나요? 체외 노출되었을 때 어떻게됩니까, BCM은 골 형성과 지방 세포 분화를 감소시키고, IL11 식 (11)의 강한 증가를 불러 일으킨다. 게놈 넓은 마이크로 어레이는 차등 BCM에 대한 응답으로 중간 엽 세포에서 발현되는 많은 유전자를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들 유전자 중 adrenomedullin (ADM)이며, IL11, IL33, NADPH 산화 효소 4 (NOX4), 프로테오글리칸 4 (PRG4, 또는 lubricin) 및 3 (PTX3) 15 pentraxin. 멸균 뼈 칩으로부터 얻어진 BCM은 각각 14 유전자의 발현을 변경하지 못한 경우. 저온 살균을 시행하고 동결 뼈 칩에서 BCM은 할 수 있었다유전자 발현 (14)을 변경합니다. 탈회 골 기질 (DBM-CM)의 또한 에어컨 매체는 TGF-β 조절 유전자 (20)의 표현을 변경합니다. 흥미롭게도, 주위의 부드러운 조직 뼈 (21, 22)로부터 칩을 보호하는 데 콜라겐 배리어 막은, 유전자 발현의 변화 (23)에 대한 책임 BCM의 그 부분을 흡착. BCM 연구는 몇 가지 이름을, 같은 뼈 재 흡수 파골 세포와 내피 세포로 골 재생에 관여하는 다른 세포 유형으로 확장 할 수 있습니다. 전반적으로, 축적 체외 데이터는 임상 연구의 설계를위한 과학적 근거를 제공한다.
본 프로토콜은 두 가지입니다 : 첫째, BCM을 준비하는 방법을 보여줍니다. 둘째, 체외에서 중간 엽 세포를 기반으로 생물학적 활성을 테스트하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
뼈 에어컨 매체는 골 재생의 초기 단계 동안 뼈 이식의 공개 활동을 반영한다. 여기에 설명 된 프로토콜이 골 재생에 관여하는 세포의 다른 유형의 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 또한, 프로토콜 처리 된 뼈 또는 뼈 충전제로부터의 조건화 배지를 제조 할 수있다. 다양한 네이티브 및 처리 뼈에서 방출 요인 : 방법을 수행하고 간단한 개념에 의존하기 쉽다. 방법 BCM을 이해하는 것은 중간 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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