אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה.
שתלי עצם אוטולוגית נמצאים בשימוש נרחב בניתוח, אורתופדיה, וtraumatology פה והלסתות. שתלי עצם אוטולוגית לא רק להחליף עצם חסר, הם גם תומכים בתהליך המורכב של התחדשות עצם. התנהגות חיובית זו של autografts מיוחסת לשלושה מאפיינים: osteoconductivity, osteogenicity, וosteoinductivity. עם זאת, יש היבט נוסף: העצם שתל לשחרר מספר עצום של מולקולות, כולל גורמי גדילה, אשר יכול למקד תאי mesenchymal המעורבים בהתחדשות עצם. המאפיינים אוטוקריני של שתלי עצם ניתן ללמוד במבחנה על ידי השימוש במדיום מיזוג עצם (BCM). כאן אנו מציגים פרוטוקול על איך להכין מדיום מיזוג עצם מעצם קליפת המוח חזיר ילידים, ועצם שעבר תהליך עיבוד או איבוד מינרלים תרמיים. תאים יכולים להיות חשופים ישירות לBCM או זורעים על ביו-חומרים, כגון ממברנות קולגן, ספוג בעבר עם BCM. אנחנו נותנים דוגמאות במבחנת bioassaי"ש עם תאי mesenchymal בביטוי של גנים מוסדרים TGF-β. הפרוטוקולים שהוצגו לעודד לחשוף עוד יותר את ההשפעות אוטוקריני של שתלי עצם במהלך התחדשות עצם ולפתוח נתיב למחקר translational בתחום הרחב של ניתוח שחזור.
עצם אוטולוגית נעשה שימוש נרחב לגשר פגמים שנפלו כתוצאה ממום, ניתוח resective, ניתוח שחזור טראומה, ולפני מיקום שתל 1,2. הבנת העקרונות הביולוגיים של כמה תלי עצם לתמוך בתהליך של איחוד שתל היא לא מפתח היחיד להבין מדוע autografts נחשב סטנדרטי בניתוח שחזור הזהב, הוא גם יונית לעיצוב המשופר של תחליפי עצם 3. ובכל זאת, איחוד שתל הוא מהיר יותר עם עצם אוטולוגית לעומת עצם תחליפי 4,5. לפיכך, הוא הכרחי כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים ותאיים שגורמים עצם אוטולוגית כל כך יעיל לתמיכה בהתחדשות עצם.
ישנם שלושה מאפייני ספר לימוד של autografts שנחשבים לתמיכה בתהליך האיחוד 6,7. העצם ראשון, אוטולוגית הוא osteoconductive, מתן הדרכה לעצם החדש שנוצר לגדוללפגם. שנית, עצם אוטולוגית הוא osteogenic, כלומר הוא מכיל תאי mesenchymal שיכול להתמיין לosteoblasts 8. עצם שלישי, אוטולוגית הוא osteoinductive כגורמי גדילה כמו חלבוני המוךפו"גנטי העצם קבורים במטריצה יכולים להתחיל בתהליך של endochondral או אפילו יצירת עצם intramembranous 9. יש היבט נוסף: שבבי עצם מוכנים טרי להחזיק פונקציה אוטוקריני מבוססת על התצפיות במבחנה עם "בינוני מותנה עצם" 10-15. גם את ההשפעה של myelopoiesis יצוין 16. טווח דומה "בינוני עצם demineralized מיזוג מטריצה" כבר נטבע בשנת 1996 ותומך ברעיון הכללי של פונקציה אוטוקריני של עצם, גם כאשר מעובד על ידי איבוד מינרלים 17. למטרות שלנו, BCM יכול להיות מוכן מחזיר טרי לסתות 10,11. ניתוחי proteomic של BCM חשפו את ההרכב המורכב, הכוללים למעשה צמיחהORS ומרכיבים של מטריקס 10, גם הרחבת ידע הקיים בפרוטאזום של כל עצם 18,19. לפיכך, BCM צריך לשקף את הפעילות המסחרית של שינויים שונים של שתלי עצם במבחנה.
מה קורה כאשר תאי mesenchymal, למשל אלה מבודדים משבבי עצם או מרקמות רכות בעל פה, נחשפים לBCM? במבחנה, BCM מפחית osteogenic ובידול adipogenic, ומעורר עלייה חזקה של ביטוי IL11 11. הגנום microarray הרחב גילה גנים רבים יותר לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאי mesenchymal בתגובה לBCM. בין הגנים הללו adrenomedullin (ADM) הם, IL11, IL33, מונואמין NADPH 4 (NOX4), פרוטאו 4 (PRG4, או lubricin) וpentraxin 3 (PTX3) 15. BCM מתקבל משבבי עצם autoclaved לא הצליח לשנות את הביטוי של גנים בהתאמה 14. BCM משבבי עצם שעברו פסטור והקפאה היה מסוגללשנות ביטוי גני 14. בינוני גם מותנה של מטריצת demineralized עצם (DBM-CM) משנה את הביטוי של TGF-β-מוסדרת גנים 20. מעניין לציין, קרומי מחסום קולגן משמשים להגן על שבבי עצם מהרקמות הרכות סביב 21,22, נספחים אותם חלקים של BCM שאחראים לשינויים בביטוי הגנים 23. מחקר BCM יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים מעורבים בהתחדשות עצם כגון osteoclasts resorbing-עצם ותאי האנדותל, עד כמה שם. בסך הכל, במבחנה נתוני צבירה לספק את הבסיס המדעי לעיצובו של מחקר פרה-קליני.
הפרוטוקול הנוכחי הוא כפול: ראשית, הוא מראה כיצד להכין BCM. שנית, הוא מראה איך לבדוק הפעילות הביולוגית שלה מבוסס על תאי mesenchymal במבחנה.
בינוני-מותנה עצם משקף את הפעילות המסחרית של שתלי עצם בשלבים המוקדמים של התחדשות עצם השלבים. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים ללמוד את תגובת סוגים שונים של תאים מעורבים בהתחדשות עצם של. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי להכין מדיום מותנה ממילוי עצם או עצם מעובד. השיטו…
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Pig Mandibles | Local bucher | ||
Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
Primers | Microsynth | ||
SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
PBS | Roche | 11666789001 |